黏蛋白1在低分化胃癌細胞中的表達及臨床意義

張 波，邸雅南，彭德銀

北京航天總醫院消化內科，北京 100076

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發生、發展是一個多因素、多步驟的復雜過程。隨著人們對腫瘤研究的不斷深入，黏蛋白1（mucin1，MUC1）作為黏蛋白家族中的重要成員之一，在胃癌中的表達和轉移中的作用也日益凸顯出來。本文就MUC1在轉化的可傳代人胃黏膜上皮細胞系（GES-1）和低分化胃腺癌細胞系（BGC-823）中的表達及其意義進行探討。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和細胞株處理

SV40病毒轉化的可傳代人胃黏膜上皮細胞系（GES-1）由北京市腫瘤防治研究所提供；低分化胃腺癌細胞系（BGC-823）由哈醫大腫瘤研究所提供。GES-1和BGC-823用含15%滅活胎牛血清和適量抗生素的RPMI Medium 1640培養液，在含5%CO2、37℃條件下培養。在24孔板中每孔均放置5 mm×5 mm的蓋玻片一塊，并加入對數期的GES-1、BGC-823 細胞分別為（4×104）、（10×104）個，貼壁生長至占蓋玻片面積的80%時，進行固定、染色。

1.2 試劑

羊抗人MUC1多克隆抗體購自SANTA CRUZ公司；FITC-兔抗山羊IgG購自北京中杉；RPMI Medium 1640購自GIBCO；FBS購自四季青公司。

1.3 間接免疫熒光染色法檢測黏蛋白1在胃黏膜上皮細胞系和低分化胃腺癌細胞系中的表達

棄去24孔板中培養液，滴加pH 7.4的PBS沖洗標本，輕微震蕩；4%多聚甲醛室溫固定30 min；0.5%Triton X-100/PBS液抽提30 min；然后用PBS沖洗，取出玻片，滴加1∶200羊抗人MUC1多克隆抗體；將玻片置于濕盒內，4℃過夜；用PBS沖洗后取出玻片，滴加1∶100 FITC-兔抗山羊IgG抗體（在暗室中進行）；室溫，將玻片平放在濕盒內2 h；然后熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 結果判定

設兩組陰性對照：一組不加Ⅰ抗和Ⅱ抗，用于熒光強度的基線校正；一組僅加Ⅱ抗，用于非特異性結合對照。用熒光顯微鏡在藍色激發光下觀察結果：抗體結合處呈現綠色熒光，說明該處有MUC1的存在，判定為陽性表達細胞，如無綠色熒光呈現，判定為陰性表達細胞；重復試驗，取平均值。

1.5 統計學方法

利用多功能成像分析系統 （Motic軟件開發公司）進行MUC1的平均光密度檢測。采用SPSS 13.0軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

MUC1在GES-1中的表達均為弱陽性；而在BGC-823中MUC1的表達為強陽性，由表1可見，GES-1和BGC-823細胞系中MUC1表達（平均光密度）差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 黏蛋白1在胃黏膜上皮細胞系和低分化胃腺癌細胞系中的表達

3 討論

MUC1是一種在上皮性腫瘤高度或異常表達的膜糖蛋白，是腫瘤的侵襲轉移及易感性等有關的重要基礎[1]，MUC1在所有正常及癌變的多種組織中均表達，而在間葉組織來源的淋巴結中不表達，因此可作為某些上皮腫瘤發生淋巴結轉移的有效標志物[2]。

本實驗中，應用間接免疫熒光法對MUC1在GES-1和BGC-823中的表達和定位進行檢測。實驗結果顯示，MUC1在兩種細胞系中的表達是有差異性的。侵襲和轉移潛能高的BGC-823中MUC1的表達率高于GES-1，這說明MUC1在細胞中的異常表達加速了腫瘤的發生和發展，暗示著 MUC1基因的產物以某種方式參與了致癌和轉移過程。

MUC1基因編碼Ⅰ型跨膜胞膜表面多種腫瘤細胞內MUC1呈過度表達，以往對結腸癌、胰腺癌及乳腺癌的研究發現，過度表達的MUC1可賦予腫瘤生長與轉移性質，使腫瘤侵襲性增加[3-6]。MUC1促進腫瘤細胞增殖可能與以下兩條信號通道活化有關：一是核因子-κB（NF-κB）信號通道活化，另一機制涉及Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）信號通道活化。已發現MUC1基因啟動子區有κB結合位點，而胃癌等多種癌腫中存在NF-κB活化[7-8]，活化的NF-κB作為細胞增殖促進因子及抗凋因子可以促進腫瘤細胞增殖；另外，NF-κB作為轉錄因子反過來促進MUC1等下游基因轉錄，進一步促進腫瘤細胞增殖。MUC1分子末端與β-連環蛋白相結合后定位于細胞核內，參與細胞周期素D1（cyclin D1）等下游基啟動子活化，上調細胞周期素D1等基因表達，促進腫瘤細飽增殖[9-10]。

MUC1在腫瘤細胞中異常過量表達，這與MUC1的C-ter亞基介導的C-Src信號途徑有關[11]，其過量表達可以抑制細胞凋亡、促進相關基因的轉錄，并導致細胞轉化。MUC1亦可通過在細胞表面的過度表達減小細胞-細胞、細胞-細胞外基質的黏附使腫瘤細胞易于從原發部位脫離，從而更利于腫瘤的轉移。Beya等[12]提出了腫瘤干細胞（cancer stem cell）的概念，C1arke等[13]首次成功地從乳腺癌分離篩選出表達CD44+和ESA的細胞，在小鼠實驗中證實了腫瘤干細胞的存在，有學者認為，MUC1是胃癌腫瘤干細胞的另一個重要標志物。因此，筆者下一步的工作重點將集中探討MUC1在胃癌的侵襲和轉移中發揮的具體作用，并作更深一步的研究，為以后利用細胞系研究腫瘤的轉移和基因治療實驗提供了理論基礎和可行性依據。

MUC1表達可作為胃癌惡性程度高低的標志，進一步探討MUC1表達與胃癌發生、發展、轉移的關系，對指導臨床診斷、判斷預后及腫瘤免疫治療有很重要的意義[14]。但由于胃癌發生和轉移是一個涉及多環節的復雜過程，結合其他基因表達的多因素綜合分析，有益于提高對轉移機制的深入認識，更利于為臨床治療提供正確指導。

[1]Beatson RE,Taylor Papadimitriou J,Burchell JM.MUC1 immunotherapy[J].Immunotherapy,2010,2(3):305-27.

[2]Lacunza E,Ferretti V,Barbeito C,et al.Immunohistochemical evidence of Muc1 expression during rat embryonic development[J].Eur J Histochem,2010,26,54(4):49.

[3]Schroeder JA,Masri AA,Adriance MC,et al.MUC1 overexpression results in mammary gland tumorigenesis and prolonged alveolar differentiation[J].Oncogene,2004,23(34):5739-5747.

[4]Hinoda Y,Ikematsu Y,Horinochi M,et al.Increased expression of MUC1 in advanced pancreatic cancer [J].Gastroenterol,2003,38(12):1162-1166.

[5]Tamada S,Goto M,Nomoto M,et al.Expression of MUC1 and MUC2 mucins in extrahepatic bile duct carcinomas:its relationship with tumor progression and prognosis[J].Pathol Int,2002,52(11):713-723.

[6]Mukhopadhyay P,Chakraborty S,Ponnusamy MP,et al.Mucins in the pathogenesis of breast cancer:Implications in diagnosis,prognosis and therapy[J].Biochim Biophys Acta,2011,1815(2):224-240.

[7]Merlin J,Stechly L,De Beaucé S,et al.Galectin-3 regulates MUC1 and EGFR cellular distribution and EGFR downstream pathways in pancreatic cancer cells[J].Oncogene,2011,30(22):2514-2525.

[8]Sasaki N,Morisaki T,Hashizume K,et al.Nuclear factor-kappaB p65(RelA)transcription factor is constitutively activated in human gastric carcinoma tissue[J].Clin Cancer Res,2001,7(12):4136-4142.

[9]Huang L,Ren J,Chen D,et al.MUC1 cytoplasmic domain coactivates wnt target gene transcription and confers transformation[J].Cancer Biol Ther,2003,2(6):702-706.

[10]張卓,鄒麗娟,田瑩瑩.β-欖香烯乳聯合照射對肺腺癌A549細胞凋亡及KU70基因表達的影響[J].中國腫瘤臨床,2010,37(4):184.

[11]Hu XF,Yang E,Li J,et al.MUC1 cytoplasmic tail:a potential therapeutic target for ovarian carcinoma [J].Expert Rev Anticancer Ther,2006,6(8):1261-1271.

[12]Beya E,Morrison SJ,Clake MF,et al.Stem cells cancer and cancerstem cells[J].Nature,2001,414(11):105-111.

[13]C1arke MF,Morrison SJ,Wicha MS.Isolation and use of solid tumor stem cells[P].United States Petent Applicatton,2002,200220119565.

[14]Sherven Sharma,Minu K Srivastava,Marni Harris White,et al.MUC1 peptide vaccine mediated antitumor activity in non-small cell lung cancer[J].Expert Opinion on Biological Therapy,2011,11(8):987-990.