補(bǔ)腎健脾養(yǎng)血活血法改善血管性認(rèn)知障礙大鼠行為學(xué)障礙的研究

沈雙宏 ，沈曉東，吳同玉，龔德貴，毛敬潔，杜 建

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350108；2.黑龍江省農(nóng)墾第二醫(yī)院中醫(yī)科，黑龍江佳木斯 154007；3.福建省第二人民醫(yī)院康復(fù)科，福建福州 350003

血管性認(rèn)知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是由腦血管病危險(xiǎn)因素明顯的腦血管病（如腦梗死、腦出血）或不明顯的腦血管病（如白質(zhì)疏松、慢性腦缺血）引起的認(rèn)知功能障礙[1]。采用血管性認(rèn)知障礙的概念，極大地提高對由血管病變或血管危險(xiǎn)因素引起的各種認(rèn)知障礙的認(rèn)識，防治癡呆的發(fā)生。既往研究表明，補(bǔ)腎健脾養(yǎng)血活血法治療血管性癡呆取得了良好效果，本研究探討補(bǔ)腎健脾養(yǎng)血活血法立方的復(fù)方中藥對VCI大鼠行為學(xué)障礙的影響，揭示其對VCI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥物

動(dòng)物選用6個(gè)月齡雄性SD大鼠（購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），體重為250～300 g，共70只。

復(fù)方中藥康欣膠囊由福建屏山制藥有限公司（批號：900418；規(guī)格：0.3 g/粒）提供。復(fù)方由女貞子、枸杞子、菟絲子、何首烏、黃精、黃芪、淫羊藿、當(dāng)歸、丹參、丹皮、酸棗仁、菊花、山楂等藥物組成。簡化方由黃芪、淫羊藿、丹參、當(dāng)歸組成。各組用藥量2.43 g/kg，相當(dāng)于人常用劑量。西藥喜得鎮(zhèn)由瑞士山德士藥廠與天津華津制藥廠合作生產(chǎn)[（91）衛(wèi)藥準(zhǔn)字X-156 號，1 mg/片]，混懸液濃度為 0.027 mg/ml，相當(dāng)于人常用劑量。硝普鈉，由北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：0305072。

1.2 血管性認(rèn)知障礙動(dòng)物模型的建立

VCI大鼠的造模方法：采用王蕊等[2]造模方法并加以改進(jìn)：分將大鼠用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定在手術(shù)臺上，常規(guī)消毒，取頸正中切口，鈍性剝離結(jié)締組織和頸前肌群，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，腹腔注射硝普鈉2.5 ml/kg后，無創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 min，再通10 min，再夾閉10 min，再通后，永久結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，并剪斷。傷口灑青霉素粉適量，縫合傷口。假手術(shù)組手術(shù)過程同模型組，但不阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不注射硝普鈉，在手術(shù)過程中，保持動(dòng)物肛溫（37.0±0.5）℃。

1.3 分組與給藥

造模前按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)抽取10只為假手術(shù)組。其余大鼠進(jìn)行造模。在造模后存活（術(shù)中死亡20只）的40只大鼠隨機(jī)分為康欣膠囊復(fù)方中藥組（復(fù)方組）、康欣膠囊簡化方中藥組（簡方組）、西藥對照組、模型組，每組10只。造模后第2周予以每日胃灌注（4.5 ml/kg各種液體），假手術(shù)組和模型組用生理鹽水灌胃，復(fù)方組、簡方組和西藥對照組分別予康欣膠囊全方、康欣膠囊簡化方和喜得鎮(zhèn)混懸液，均每日給藥1次，連續(xù)灌藥3周。給藥兩周后開始Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，共6 d，期間繼續(xù)給藥，次日處死動(dòng)物。

1.4 行為學(xué)觀察

Morris水迷宮[3]：水迷宮的水池直徑 100 cm，深 50 cm，水深30 cm，水溫（26±2）℃，水面覆一層泡沫塑料屑，池壁上4個(gè)等距離點(diǎn)分水池為4個(gè)象限，池壁外標(biāo)4個(gè)入水點(diǎn)，任選一象限在其中央放置平臺。平臺無色透明，直徑6cm，高28 cm，平臺沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。Morris水迷宮主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。

定位航行實(shí)驗(yàn)：檢測大鼠對平臺位置的學(xué)習(xí)和記憶的能力。連續(xù)訓(xùn)練5 d，每日上午、下午兩個(gè)時(shí)段，兩次間隔8 h以上。在每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練4次，分別從4個(gè)象限的入水點(diǎn)將大鼠放入水中。如果大鼠在60 s內(nèi)爬上平臺，并停留3 s以上，則認(rèn)為大鼠找到平臺，此為潛伏期。如果60 s內(nèi)大鼠未能找到平臺，則拖拽其尾部，將其引導(dǎo)到平臺，熟悉10 s，此時(shí)潛伏期按60 s計(jì)算。每次訓(xùn)練間隔為5 min。計(jì)算每一時(shí)段4個(gè)方向潛伏期的平均數(shù)，然后把每一日上午、下午兩個(gè)時(shí)段潛伏期的平均數(shù)作為該日的游泳結(jié)果。

空間探索實(shí)驗(yàn)：測試大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的能力。定位航行實(shí)驗(yàn)后，即在第6天上午，撤去平臺，取任意一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠放入水中，觀察并記錄60 s內(nèi)大鼠穿過原平臺區(qū)域的次數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后血管性認(rèn)知障礙大鼠一般情況

麻醉藥蘇醒后大鼠活動(dòng)能力下降，自發(fā)運(yùn)動(dòng)減少，少數(shù)大鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)增加。48 h內(nèi)所有存活大鼠都逐漸恢復(fù)正常飲食及大便。

2.2 各組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少（P＜0.05）；復(fù)方組、簡方組、西藥對照組與模型組比較，逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺區(qū)域的次數(shù)明顯增多（P＜0.05）；復(fù)方組、簡方組、西藥對照組兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺區(qū)域次數(shù)比較（）

表1 各組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺區(qū)域次數(shù)比較（）

注：與模型組比較，▲P＜0.05，△P＜0.05

組 別 例數(shù)1010101010假手術(shù)組模型組西藥對照組復(fù)方組簡方組逃避潛伏期 （s）13.85±4.71▲31.69±6.3318.42±7.35▲14.57±3.99▲16.93±2.54▲穿越平臺區(qū)域次數(shù)（次）6.70±1.75△3.50±0.956.10±2.46△6.90±1.86△7.20±1.75△

3 討論

臨床和神經(jīng)心理學(xué)研究表明，按照癡呆的診斷標(biāo)準(zhǔn)不能發(fā)現(xiàn)許多血管因素導(dǎo)致的認(rèn)知障礙，尤其是未達(dá)到癡呆標(biāo)準(zhǔn)者，也就不能實(shí)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)和早期預(yù)防。因此，一些學(xué)者提出應(yīng)該用更寬泛的VCI概念來代替血管性癡呆，目的是將血管性癡呆的診斷從傳統(tǒng)的癡呆標(biāo)準(zhǔn)中擺脫出來。VCI是一種可以預(yù)防的癡呆，早期治療具有可逆性[4]。因此，廣泛采用VCI診斷標(biāo)準(zhǔn)，對處于早期或癥狀前期的患者進(jìn)行治療及Ⅱ級預(yù)防和Ⅰ級預(yù)防，意義深遠(yuǎn)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病的發(fā)病與腎精不足、五臟虧虛、氣血不足有密切關(guān)系。康欣膠囊以補(bǔ)腎健脾、養(yǎng)血活血為立法，方中女貞子、黃精等補(bǔ)腎填精，淫羊藿溫腎壯陽，當(dāng)歸養(yǎng)血活血，佐以丹皮、山楂等藥。藥理研究表明，方中諸藥多具有清除氧自由基、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抗動(dòng)脈粥樣硬化、減輕腦缺氧缺血后再灌注損傷等多種作用。既往的研究顯示，康欣膠囊有效增加海馬、下丘腦等部位乙酰膽堿（Ach）、多巴胺（DA）的合成；防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[5-6]。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是檢測空間方向、反射時(shí)間、視知覺和結(jié)構(gòu)應(yīng)用等空間學(xué)習(xí)記憶能力。本實(shí)驗(yàn)選用逃避潛伏期、通過平臺次數(shù)等指標(biāo)，來反映大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。大鼠空間記憶力越好，其逃避潛伏期越短，通過平臺次數(shù)也越多。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠的各指標(biāo)均明顯優(yōu)于模型組，說明模型組大鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，造模成功。復(fù)方組、簡方組、西藥對照組與模型組比較，逃避潛伏期明顯縮短、穿越平臺區(qū)域的次數(shù)明顯增多，說明各用藥組均能明顯改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

對于血管性認(rèn)知障礙這個(gè)新概念，目前中醫(yī)、西醫(yī)都處于探索研究階段。中醫(yī)藥在改善癥狀，延緩病程進(jìn)展，減緩長期服用西藥的不良反應(yīng)，提高療效等方面有一定的優(yōu)勢，因此通過本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察，以期能為中醫(yī)藥對VCI的深入研究有所裨益。

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[5]蔡晶,杜建,劉錫棐,等.康欣膠囊及其拆方對腎虛血瘀型大鼠神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的研究[J].中醫(yī)雜志,2007,48(5):453-455.

[6]Jing C,Fan Z,Jian D.Effects of glossy privet fruit on neural cell apoptosis in the cortical parietal lobe and hippocampal CA1 region of vascular dementia rats [J].Neural Regeneration Research,2008,3(25):1192-1211.