長期飲酒對大鼠內外源性肺損傷時還原性谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和丙二醛的影響

劉義德 ，劉 志

1.沈陽急救中心急診科，遼寧沈陽 110006；2.中國醫科大學附屬第一醫院急診科，遼寧沈陽 110001

急性肺損傷 （acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指由心源性以外的各種肺內、外致病因素導致的急性進行性呼吸衰竭，臨床表現為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥。引起ALI/ARDS的原因很多，可以分為內源性因素（嚴重肺炎等）和外源性因素（胰腺炎、休克等）[1]。國內外研究發現，肺內因素和肺外因素引起的ALI在發病機制、臨床表現和治療效果上有所不同。近年來，在臨床治療觀察中人們發現，長期飲酒能明顯增加危重患者ALI/ARDS發病率及病情嚴重程度[2]，但其發生機制仍未明確。新近研究表明，可能與肺組織氧化及抗氧化機制有關[3]。為明確長期飲酒對肺內、外源性因素引起肺損傷的發病機制是否存在差異，本研究在建立長期飲酒大鼠模型后，分別給予氣管內注入和腹腔內注射大腸桿菌脂多糖（LPS）建立內、外源因素引起的肺損傷模型，觀察肺、肝組織還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）的變化，探討在長期飲酒情況下兩種原因引起的肺損傷是否存在差異，為臨床治療提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇雄性SD大鼠36只，體重210～250 g，均由中國醫科大學實驗動物部提供；飼養環境溫度為（23±2）℃，日照時間為12 h/d；分6籠飼養，每籠6只。各大鼠間基本情況比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 試劑和儀器

試劑：LPS購自Sigma公司，GSH檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。儀器：血氣分析儀（AVL公司，瑞士），低溫高速離心機（日立公司，日本），紫外分光光度計（上海第三分析儀器廠，中國），電子天平儀，恒溫水浴箱，電動勻漿器。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠長期飲酒模型建立 將大鼠隨機分為飲水組和飲酒組，每組18只。按照文獻[4]中方法，建立大鼠長期飲酒模型，先將大鼠適應喂養3 d，然后將6%酒精替代飲水給予飲酒組大鼠飲用3 d，再換成10%酒精飲用4 d，以后給予20%酒精連續飲用5周。飲水組大鼠自由飲水，兩組飼料均為清潔級全營養顆粒飼料。

1.3.2 內、外源性肺損傷模型建立 飲酒模型建立6周后，將飲水組和飲酒組大鼠各隨機分成3組，分別為單純飲水組6只，飲水內源性肺損傷組6只，飲水外源性肺損傷組6只；單純飲酒組6只，飲酒內源性肺損傷組6只，飲酒外源性肺損傷組6只。內源性肺損傷組大鼠經稱重后予以1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，經頸正中切口分離氣管，用7號針頭刺入氣管緩慢滴入LPS（15 mg/kg）建立內源性肺損傷模型。外源性肺損傷大鼠予以LPS（15 mg/kg）腹腔注射建立外源性肺損傷模型。

1.3.3 標本采集 肺損傷模型建立4 h后，給予1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，打開腹腔，經腹主動脈取血測PaO2值，經下腔靜脈抽血 4 ml，4℃3000 r/min離心10 min取上清，凍存-80℃冰箱。隨后放血處死大鼠，打開腹腔將雙肺完整取出，用冰鹽水仔細漂洗，清除血跡，干紗布拭干，置于冰塊上。取右肺上葉組織測定濕重后，放入80℃烤箱烘烤48 h后稱量干重，計算肺組織濕干比（W/D）值，將剩余右肺組織放入-80℃冰箱凍存待檢。用自制灌洗針將3 ml冰鹽水注入左肺組織進行肺泡灌洗，反復3次，收集灌洗液，1000 r/min離心5 min，取上清，存于-80℃冰箱待檢。

1.3.4 肺、肝組織還原性谷胱甘肽、超氧化物歧化酶及丙二醛含量測定 取凍存的肺、肝組織稱重后剪碎，按 1∶9（mg∶ml）比例加入4℃生理鹽水，用電動勻漿器勻漿后，3000 r/min離心15 min，取上清液，保存于-20℃冰箱中。 GSH、SOD、MDA 檢測方法按照試劑說明書進行。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，各組均數比較采用單因素方差分析（ANOVA），采用最小顯著差法（1east significant difference，LSD）作兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠氧分壓及肺濕干比變化

單純飲酒組與單純飲水組PaO2比較差異無統計學意義（P>0.05），肺損傷各組PaO2水平均明顯低于單純飲水組（P<0.05）；飲酒內、外源性肺損傷組PaO2水平降低程度比飲水內、外源性肺損傷組更顯著（P<0.05），且內源性肺損傷組PaO2水平下降較外源性肺損傷組明顯（P<0.05）。單純飲水組與單純飲酒組間肺W/D值差異無統計學意義（P>0.05），肺損傷各組相對于單純飲水組W/D值均明顯增高（P<0.05）；飲酒肺損傷組W/D值較飲水肺損傷對應組W/D值升高更加明顯 （P<0.05），飲酒組中內、外源性肺損傷的W/D值差異無統計學意義（P>0.05）。 見表 1。

2.2 各組大鼠肝組織中還原性谷胱甘肽及丙二醛含量變化

單純飲酒組與單純飲水組比較，肝組織中GSH含量下降（P<0.05），MDA 含量上升（P<0.05）；肺損傷各組較單純飲水組，GSH含量均下降，MDA含量均上升（P<0.05）；飲酒肺損傷組與飲水肺損傷對應組比較，GSH及MDA變化程度更加顯著 （P<0.05），且外源性肺損傷組較內源性肺損傷組變化更加明顯（P<0.05）。見表2。

表1 各組間大鼠氧分壓及肺濕干比變化情況（）

表1 各組間大鼠氧分壓及肺濕干比變化情況（）

注：與單純飲水組比較，*P<0.05；與飲水內源性肺損傷組比較，△P<0.05；與飲酒外源性肺損傷組比較，☆P<0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

組別 只數單純飲水組飲水內源性肺損傷組飲水外源性肺損傷組單純飲酒組飲酒內源性肺損傷組飲酒外源性肺損傷組666666 PaO2（mm Hg）102.00±11.9768.00±5.72*75.00±4.41*△☆99.00±9.1859.00±6.22*△☆68.00±5.29*W/D值4.31±0.195.52±0.25*5.27±0.23*☆4.39±0.166.47±0.14*△6.26±0.10*

表2 各組大鼠肝組織中還原性谷胱甘肽及丙二醛含量變化（）

表2 各組大鼠肝組織中還原性谷胱甘肽及丙二醛含量變化（）

注：與單純飲水組比較，*P<0.05；與飲水內源性肺損傷組比較，△P<0.05；與飲酒外源性肺損傷組比較，☆P<0.05

組別 只數單純飲水組飲水內源性肺損傷組飲水外源性肺損傷組單純飲酒組飲酒內源性肺損傷組飲酒外源性肺損傷組666666 GSH含量（mg/gprot）7.68±0.395.96±0.37*5.44±0.41*△☆6.12±0.88*4.29±0.78*△☆2.63±0.47*MDA含量（nmol/mgprot）4.75±0.327.04±0.52*8.53±0.97*△☆6.44±0.53*10.12±0.65*△☆13.71±0.95*

2.3 各組大鼠肺組織中還原性谷胱甘肽、超氧化物歧化酶及丙二醛含量變化

單純飲酒組大鼠肺組織GSH、SOD含量較單純飲水組下降（P<0.05），MDA 含量升高（P<0.05），內、外源性肺損傷組GSH、SOD含量較單純飲水組下降，MDA含量升高（P<0.05）；飲酒肺損傷各組較飲水肺損傷對應組改變更顯著（P<0.05），外源性肺損傷組較內源性肺損傷組GSH、MDA含量變化更明顯（P<0.05），但SOD變化差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肺組織中還原性谷胱甘肽、超氧化物歧化酶及丙二醛含量變化（）

表3 各組大鼠肺組織中還原性谷胱甘肽、超氧化物歧化酶及丙二醛含量變化（）

注：與單純與飲水組比較，*P<0.05；與飲水內源性肺損傷組比較，△P<0.05；與飲酒外源性肺損傷組比較，☆P<0.05

組別 只數單純飲水組飲水內源性肺損傷組飲水外源性肺損傷組單純飲酒組飲酒內源性肺損傷組飲酒外源性肺損傷組666666 SOD含量（U/mgprot）91.23±2.4980.13±7.46*74.37±2.87*☆84.49±5.02*68.76±9.43*△68.41±5.04*GSH含量（mg/gprot）1.90±0.191.61±0.18*1.38±0.18*☆△1.62±0.21*1.32±0.19*☆△1.05±0.19*MDA含量（nmol/mgprot）1.49±0.132.19±0.18*3.76±0.18*☆△1.82±0.17*3.50±0.36*☆△5.76±0.63*

3 討論

1996年，Moss等[2]在臨床中對351例危重患者進行觀察時發現，長期飲酒明顯增加ARDS的易感性及疾病嚴重程度。此后人們開始關注飲酒與ARDS之間的關系。目前研究顯示，可能有多種機制參與ARDS的發生，其中，氧化應激反應占重要地位。ARDS根據病因不同，分為內源性ARDS（ARDSP）和外源性 ARDS（ARDSexp），而長期飲酒對內、外源性肺損傷時的氧化應激反應是否存在差異的研究尚未見報道。本研究建立了長期飲酒后內、外源性肺損傷的動物模型，以觀察其抗氧化物質的改變是否存在差異。

目前研究認為，機體主要抗氧化物質有兩大類：低分子自由基清除劑（GSH）和酶性清除劑（SOD）。正常生理狀態下，氧自由基的產生與清除維持動態平衡。當機體受到刺激時，如感染、炎癥、組織缺氧、缺血等病理情況時，氧自由基產生過多而清除劑活力下降則會導致細胞的廣泛損傷。MDA是氧自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸所形成的脂質過氧化產物，其含量的多少能反映組織或細胞脂質被氧化的程度。

本研究結果顯示，單純飲酒組大鼠肝臟GSH含量下降，MDA含量上升，證明了長期飲酒會導致肝臟氧化還原系統失衡，肝細胞受到損傷。同時，肝臟是機體各類物質代謝的主要場所，機體的GSH主要由肝臟產生，GSH通過參與中和氧自由基、減少自由基對生物膜及DNA的攻擊、抗脂質過氧化損傷及解毒等作用而對機體發揮保護作用。GSH對肺臟也有非常重要的保護作用，可拮抗氧自由基引起的肺泡上皮細胞損傷[5]，并促使肺內脂質過氧化物分解為無毒的代謝產物，使肺臟氧化及抗氧化系統保持動態平衡[6]。肺臟中的GSH主要來源于肝臟，因此，當肝臟功能受損，GSH含量下降時，也會相應導致肺臟GSH含量下降，從而影響到肺組織氧化還原系統，引起系統失衡。本研究結果顯示，飲酒組大鼠肺組織GSH、SOD含量均下降，MDA含量升高，并且肺臟的GSH、MDA變化同肝臟GSH、MDA含量變化一致。原因可能由于肺組織的GSH、SOD含量下降，使其清除氧自由基的能力明顯下降，引起脂質過氧化，產生MDA，氧化還原系統失衡，導致肺泡巨噬細胞功能損傷，增加肺損傷的易感性[7]。

從本研究結果中可以看到，當給予LPS形成大鼠肺損傷后，飲水大鼠肺損傷各組MDA含量均較未損傷組明顯升高，而GSH及SOD含量均明顯下降。表明在肺損傷時，大鼠的肺組織抗氧化物質減少，過氧化物產生增多。同時飲酒肺損傷各組無論在PaO2、肺W/D值，還是氧化還原指標的改變與飲水損傷各組相比均更加顯著。本研究也發現，外源性肺損傷時肝、肺組織的氧化還原指標改變程度更顯著于內源性肺損傷。分析其機制可能因為肝臟具有清除LPS功能[8]，長期飲酒產生的乙醛等代謝產物通過氧化作用使肝細胞已經受損，肝臟清除LPS功能下降，當給予LPS時，肝臟細胞因子生成增加，進一步加重肝細胞損傷，形成“二次打擊”[9]，使肝臟抗氧化能力下降更加明顯，同時長期飲酒已使肺臟抗氧化物質含量下降，兩種因素共同作用，形成惡性循環，使肺損傷加重。當長期飲酒后出現外源性肺損傷時，LPS由肺外途徑進入機體內，激活炎性介質，發生全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），在此過程中肝臟作為主要的解毒和抗炎器官，受到 “二次打擊”重，抗氧化物質GSH生成下降明顯，MDA含量上升，相應的肺臟氧化還原指標改變也更明顯。肺臟氧化還原指標的改變是全身氧化及抗氧化系統失衡的一部分。而內源性肺損傷則主要累及肺泡上皮，并促使肺泡巨噬細胞和炎癥反應鏈的激活，導致肺內炎癥[10]，為局部氧化應激反應，在此過程中肝臟相比外源性肺損傷時受到的“二次打擊”程度輕，引起的全身氧化應激反應小，因此，肺臟氧化還原指標改變程度輕于外源性肺損傷。

綜上所述，長期飲酒可引起肺組織抗氧化物質含量下降，抗氧化能力減弱，脂質過氧化增加，增加了ALI的易感性和病情嚴重程度，并且對外源性肺損傷影響顯著高于內源性肺損傷。這一結果為今后治療不同誘因引起的ARDS提供了新的思路。

[1]Gattinoni L,Pelosi P,Suter PM,et al.Acute respiratory distress syndrome caused by pulmonary and extra pulmonary disease.Different syndromes[J].Am J Respir Crit Care Med,1998,158(1):3-11.

[2]Moss M,Bucher B,Moore FA,et al.The role of chronic alcohol abuse in the development of acute respiratory distress syndrome in adults[J].JAMA,1996,275(1):50-54.

[3]Guidot DM,Brown LAS.Mitochondrial glutathione replacement restores surfactant synthesis and secretion in alveolar epithelial cells of ethanolfed rats[J].Alcohol Clin Exp Res,2000,24(7):1070-1076.

[4]Holguin F,Moss I,Brown LA,et al.Chronic ethanol ingestion impairs alveolar typeⅡcell glutathione homeostasis and function and predispose to endotoxin-mediated acute edematous lung injury in rats[J].J Clin Invest,1998,101(4):761-768.

[5]Kelly FJ.Gluthathione:in defence of the lung [J].Food Chem Toxicol,1999,37(10):963-966.

[6]Salvatore C,Emanuela M,Laura D,et al.Protective effects of N-acetycysteine on lung injury and red blood cell modification induced by carrageenan in the rat[J].Paseb J,2001,15(7):1187-1200.

[7]Brown LA,Ping XD,Harris FL,et al.Glutathione availability modulates alveolarmacrophagefunctioninthechronicethanol-fedrat[J].AmJPhysiol Lung Cell Mol Physiol,2007,292(4):824-832.

[8]SU GL.Lipopolysaccharides in liver injury:molecular mechanisms of kupffer cell activation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2002,283(2):256-265.

[9]Ma KL,Ruan XZ,Powis SH,et al.Inflammatory stress exacerbates lipid accumulation in hepatic cells and fatty livers of apolipoprotein E knockout mice[J].Hepatology,2008,48(3):770-781.

[10]Muller LC,Klosterhalfen B,Hauptmann S.Computed tomography and histologic results in the early stages of endotoxin injury lungs as a model for adult respiratory distress syndrome[J].Invest Radio,1993,28(1):39-45.