HPLC法同時測定發(fā)酵液中紐莫康定A0與B0的含量

張雪霞，李 寧，李曉露，林 旸，張金娟，林 毅，蔣 沁

(微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050015)

天然產(chǎn)物紐莫康定(Pneumocandins)是一類新型環(huán)脂肽類抗真菌化合物，具有環(huán)狀六肽母核和脂肪酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)[1]，將其中的紐莫康定A0和紐莫康定B0的脂肪酸側(cè)鏈脫掉后的環(huán)狀六肽母核分別是合成米卡芬凈(Micafungin)和卡泊芬凈(Caspofungin)的主要原料[2，3]。米卡芬凈和卡泊芬凈是一類全新的棘白菌素(Echinocandins)類抗真菌藥，對大多數(shù)念珠菌(包括一些對唑類耐藥的菌株)具有快速的殺滅作用、對大多數(shù)曲霉有抑制作用[4，5]。

紐莫康定的發(fā)酵液中含有紐莫康定A0與紐莫康定B0，同時測定紐莫康定A0與B0含量的方法尚未見報道。作者在此采用HPLC法同時測定發(fā)酵液中紐莫康定A0與B0的含量，對檢測條件進(jìn)行了考察，為同時測定發(fā)酵液中紐莫康定A0與B0的含量提供了一條有效途徑。

1 實驗

1.1 試藥、試劑與儀器

紐莫康定發(fā)酵液，華藥集團(tuán)新藥公司。

紐莫康定A0對照品(含量95.72%)、紐莫康定B0對照品(含量96.14%)，自制；分析用甲醇，色譜純，Merck公司；提取用甲醇，分析純；去離子水，自制。

高效液相色譜儀(515泵，996檢測器)，Waters公司。

1.2 對照品溶液的配制

精密稱取紐莫康定A0對照品20.0 mg、B0對照品16.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，搖勻，得混合對照品貯備液。精密量取貯備液5 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋，定容，搖勻，得混合對照品溶液。

1.3 供試品溶液的制備

量取50 mL紐莫康定發(fā)酵液，過濾，得菌絲濾餅，向菌絲濾餅中加入甲醇200 mL，超聲提取30 min，過濾，重復(fù)提取2次，合并濾液，混合均勻，用0.22 μm的膜濾過，得供試品溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱為SepaxSapphire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫為室溫；流動相為甲醇-水(體積比45∶55，內(nèi)含0.1‰三氟乙酸)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長214 nm；進(jìn)樣量10 μL。

紐莫康定A0與B0的高效液相色譜圖見圖1。

1.紐莫康定A0 2.紐莫康定B0

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長

通過二極管陣列檢測器在線掃描，紐莫康定A0與B0均為末端吸收，當(dāng)檢測波長為214 nm時，二者均可得到滿意的響應(yīng)值。因此，確定檢測波長為214 nm。

2.2 方法的線性范圍

精密量取混合對照品貯備液7.5 mL、6.0 mL、5.0 mL、4.0 mL、2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，定容，搖勻。6份溶液(含未稀釋混合對照品貯備液)在1.4色譜條件下分別進(jìn)樣，記錄峰面積，以相應(yīng)的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合線性回歸，得紐莫康定A0和B0的回歸方程分別為：

YA0=2.17×105X+1.92×104，相關(guān)系數(shù)R=0.9997，線性范圍為47.5～191.4 μg·mL-1；

YB0=2.06×105X+9.65×104，相關(guān)系數(shù)R=0.9998，線性范圍為38.4～153.6 μg·mL-1。

2.3 精密度

精密吸取供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄紐莫康定A0與B0峰面積。結(jié)果表明，紐莫康定A0峰面積的RSD為0.94%，紐莫康定B0峰面積的RSD為0.92%。

2.4 靈敏度

取紐莫康定A0濃度為10.732 μg·mL-1、紐莫康定B0濃度為8.591 μg·mL-1的對照品溶液，進(jìn)樣5 μL測定。以信噪比為3所對應(yīng)的樣品量進(jìn)行計算。結(jié)果表明，紐莫康定A0的檢測靈敏度為6.86 ng、紐莫康定B0的檢測靈敏度為5.95 ng。

2.5 穩(wěn)定性

取同批號供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、10 h進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，紐莫康定A0峰面積的RSD為1.01%、紐莫康定B0峰面積的RSD為0.96%。表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 回收率

取9份已知紐莫康定A0和B0含量的發(fā)酵液50 mL，分別按高、中、低3組加入紐莫康定A0對照品及B0對照品(組1加入10.0 mg和8.0 mg；組2加入15.0 mg和12.0 mg；組3加入20.0 mg和16.0 mg)，每組3份，按1.3方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，按色譜條件進(jìn)樣測定。計算得紐莫康定A0的平均回收率為99.15%(n=9)、RSD為0.96%；紐莫康定B0的平均回收率為99.31%(n=9)、RSD為0.98%。

2.7 重復(fù)性

取同批號發(fā)酵液，按1.3方法制備供試品溶液5份，進(jìn)樣10 μL，分別測定紐莫康定A0與B0峰面積，計算含量。結(jié)果表明，紐莫康定發(fā)酵液中A0平均含量為876.31 μg·mL-1，RSD為0.96%(n=5)；紐莫康定B0平均含量為682.74 μg·mL-1，RSD為0.94%(n=5)。

2.8 含量測定

精密吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL進(jìn)樣測定，測得3批紐莫康定A0含量(n=3)分別為862.48 μg·mL-1、877.46 μg·mL-1、871.59 μg·mL-1，RSD分別為0.95%、0.93%、0.94%；紐莫康定B0含量(n=3)分別為685.35 μg·mL-1、679.56 μg·mL-1、675.72 μg·mL-1，RSD分別為0.95%、0.93%、0.94%。

3 結(jié)論

建立了發(fā)酵液中紐莫康定A0和B0高效液相色譜檢測方法。結(jié)果表明，紐莫康定A0的檢測靈敏度為6.86 ng，紐莫康定B0的檢測靈敏度為5.95 ng；紐莫康定A0濃度在47.5～191.4 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，紐莫康定B0濃度在38.4～153.6 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系；紐莫康定A0的平均回收率為99.15%(n=9)、RSD為0.96%，紐莫康定B0的平均回收率為99.31%(n=9)、RSD為0.98%。該方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于發(fā)酵液中紐莫康定A0和B0含量的同時測定。

[1] Hensens O D，Liesch J M，Zink D L，et al.Pneumocandins fromZalerionarboricola.Ⅲ.Structure elucidation[J].The Journal of Antibiotics，1992，45(12)：1875-1885.

[2] Stone E A，F(xiàn)ung H B，Kirschenbaum H L.Caspofungin：An echinocandin antifungal agent[J].Clinical Therapeutics，2002，24(3)：351-377，329.

[3] Chandrasekar P H，Sobel J D.Micafungin：A new echinocandin [J].Clinical Infectious Diseases，2006，42(8)：1171-1178.

[4] Ishikawa J，Maeda T，Matsumura I，et al.Antifungal activity of micafungin in serum[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2009，53(10)：4559-4562.

[5] Pfaller M A，Messer S A，Boyken L，et al.Caspofungin activity against clinical isolates of fluconazole-resistantCandida[J].Journal of Clinical Microbiology，2003，41(12)：5729-5731.