高效液相色譜法測(cè)定白及中肉桂酸

麻秀萍， 楊清秋， 蔣朝暉， 陸崇玉

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽550002;2.安順市西秀區(qū)人民醫(yī)院，貴州安順561000)

白及系蘭科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥塊莖，多年生草本，分布于貴州、四川、湖南、江蘇等地，具收斂止血，消腫生肌之功效［1］，并收載于中國藥典。臨床上廣泛用于治療咳血吐血，外傷出血瘡瘍腫毒，皮膚皸裂，結(jié)核咳血，潰瘍病出血等，療效顯著。白及含黏液質(zhì)、對(duì)羥基苯甲酸、原兒茶酸、肉桂酸(Cinnamic acid)、聯(lián)芐類等化合物［2-3］。目前，藥典只收載其顯微鑒定及薄層鑒別，未見有定量測(cè)定的報(bào)道。李及等人曾對(duì)白及中的大黃素甲醚進(jìn)行定量測(cè)定，因其量甚微，沒有檢測(cè)的實(shí)際意義［4］。肉桂酸具有抗細(xì)菌、真菌作用和升高白細(xì)胞作用，是本品的有效成分之一［5］。故本實(shí)驗(yàn)采用HLPC法測(cè)定白及中肉桂酸，并進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果表明建立的方法前處理簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，為白及藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的完善提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和材料

Agilent 1100高效液相色譜儀(四元泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、化學(xué)工作站);肉桂酸對(duì)照品(C9H8O2，編號(hào)0786-9802，中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用)，乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑為分析純。

白及藥材采于貴州省關(guān)嶺縣，采集時(shí)間為2007年11月，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院董立莎教授鑒定為藥典品種蘭科植物白及 Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的新鮮塊莖。鮮品洗凈，部分去皮，皮與去皮塊莖分別低溫烘干，皮為1號(hào)樣品，去皮塊莖為2號(hào)樣品;鮮品洗凈，切片，烘干，為3號(hào)樣品;鮮品按藥典的炮制方法，蒸至無白心，去皮，切片，烘干，為4號(hào)樣品。將4份樣品粉碎，過60目篩備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為Shim-Pack VP-ODS(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.1% 磷酸溶液(29∶71);柱溫40℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm。理論塔板數(shù)按肉桂酸峰計(jì)不低于4000。在此色譜條件下，肉桂酸與其他色譜峰完全分離，峰形較好。見圖1。

圖1 肉桂酸(A)與白及藥材供試液(3號(hào)樣品)(B)色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取肉桂酸對(duì)照品適量，甲醇溶解，搖勻，制成每1 mL含肉桂酸10 μg的對(duì)照品溶液。

2.3 供試液制備 取白及粉末1.0 g，精密稱定，精密加入70%甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min(功率250 W，頻率33 kHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，并用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

24 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察 精密吸取一系列質(zhì)量濃度肉桂酸對(duì)照品溶液分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定。以峰面積為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 Y=1.43799 ×10－7X －0.000435843(r=0.9999)，肉桂酸進(jìn)樣量在0.0232～0.2088 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取肉桂酸對(duì)照品溶液(11.6 μg/mL)10 uL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，RSD值為1.02%。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取白及粉末(3號(hào)樣品)，按2.3項(xiàng)方法分別制備6份供試液，測(cè)定峰面積，計(jì)算白及藥材中肉桂酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 268.16 μg/g，RSD 為 1.15%。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試液，按上述色譜條件分別于 0、2、4、6、8 h 測(cè)定肉桂酸峰面積，RSD 值為 1.56%，結(jié)果表明白及供試液至少在8 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取0.5 g白及粉末(3號(hào)樣品)6份，精密稱定，分別精密加入肉桂酸對(duì)照品適量，按2.3項(xiàng)方法制備供試液，照上述色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果見表1。

2.5 樣品測(cè)定 分別取不同加工方法和購于不同產(chǎn)地的白及，按2.3項(xiàng)方法制備供試液，照上述色譜條件測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3份，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 白及藥材中肉桂酸測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)果與討論

3.1 提取條件的篩選 由于肉桂酸易溶于乙醚、丙酮、甲醇、苯等溶劑中，本實(shí)驗(yàn)比較了乙醚、甲醇、50%甲醇、70%甲醇，分別超聲提取30 min的提取效果，結(jié)果以70%甲醇為提取溶劑時(shí)，提取效率高，且肉桂酸峰與其他色譜峰完全分離，故本實(shí)驗(yàn)選擇70%甲醇溶液作為提取溶劑。另對(duì)提取時(shí)間20、30、60 min進(jìn)行了考察，結(jié)果提取20 min時(shí)，量較低，提取30、60 min時(shí)的量相當(dāng)，故選擇提取時(shí)間為30 min。還對(duì)溶劑的用量進(jìn)行了比較，定容至10 mL時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低，定容至50 mL時(shí)，溶液濃度過低，故定容至25 mL。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 于190～400 nm波長(zhǎng)范圍對(duì)肉桂酸進(jìn)行了掃描，經(jīng)考察在285 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，肉桂酸峰靈敏度較高，其他色譜峰干擾較小，色譜峰的分離較為理想，故本實(shí)驗(yàn)選用285 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。專屬性考察采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行峰純度檢查，在樣品色譜圖中肉桂酸峰為純峰，且溶劑對(duì)肉桂酸色譜分析均無干擾，方法的專屬性強(qiáng)。

3.3 色譜條件的選擇 比較了不同流動(dòng)相的分離效果，以甲醇-0.1%磷酸溶液(25∶75)為流動(dòng)相時(shí)，肉桂酸峰與前一個(gè)峰的分離不佳;以乙腈-0.1%磷酸(25∶75)為流動(dòng)相時(shí)，肉桂酸峰對(duì)稱性欠佳;根據(jù)肉桂酸峰與其前后兩個(gè)峰分離情況及峰形，選擇乙腈-0.1%磷酸溶液(29∶71)為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)比較了不同色譜柱Shim-Pack VP-ODS(4.6 mm×150 mm，5 μm);Eclipse XDB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm);ZOBAX SB C18(4.6 ×150 mm，5 μm)的分離情況，均達(dá)基線分離。

3.4 經(jīng)比較白及皮中肉桂酸量比去皮部分量高，按藥典的炮制方法(蒸至無白心，去皮，烘干)炮制后的白及肉桂酸量最低。提示白及應(yīng)用在抗病毒、抗菌和升高白細(xì)胞等方面時(shí)，應(yīng)用其生品，且不去皮的白及效果可能更好。另對(duì)購于不同藥店的白及藥材進(jìn)行了肉桂酸測(cè)定，結(jié)果質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低，這與炮制方法相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

致謝:貴陽中醫(yī)學(xué)院徐文芬老師給予大力幫助!

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2005年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:95.

［2］韓廣軒，王立新，王麥莉，等.中藥白及的化學(xué)成分研究［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2001，19(6):360-361.

［3］韓廣軒，王立新，顧正兵，等.中藥白及中一新的聯(lián)芐化合物［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37(3):194-195.

［4］李 及，張立新，周世玉.中藥白及的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28(2):57-58.

［5］常新全，丁麗霞主編，中藥活性成分分析手冊(cè)［M］.北京:學(xué)苑出版社，2002:674.