HPLC法和聚類分析法探討不同廠家消癌平片中綠原酸含量的一致性和穩定性

溫瑞卿， 李東輝， 王 鑫

(北京市海淀區藥品檢驗所，北京100083)

消癌平片具有抗癌、消炎、平喘作用，主要用于治療食道癌、胃癌等多種惡性腫瘤［1-4］，是當前為數不多的抗癌中成藥之一。該制劑由藥材烏骨藤(通關藤)經水煮、濃縮、加輔料壓片而成，雖然原料和工藝均比較單一，但其原料藥質量參差不齊［5-11］，且各廠家質量標準(見各廠家的散頁標準)規定項目、方法和限度不同［12］，因此各廠家批次質量的一致性無法得到有效控制。烏骨藤抗癌的藥效成分主要有酯苷、酚酸和多糖三大類，其中酯苷類成分含量低、且無對照品對照和標定，因此目前主要針對綠原酸類成分定性和定量控制制劑質量［13-15］，本研究即探討北京地區流通和使用的消癌平片中綠原酸含量差異，旨在為考察制劑質量的一致性和穩定性提供參考，為進一步制定和完善消癌平片的質量標準提供數據支持。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀，Waters2998 PDA檢測器，AS10200BT超聲波提取儀，Sartorius A200S電子天平，Sartorius BP211D電子天平，ACY-1002-U超純水機。

消癌平片，綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號:110753-200413)。

乙腈、磷酸均為色譜純，水(實驗室自制超純水，電阻率18.25 mΩ.cm)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相:乙腈 -0.4% 磷酸溶液(9 ︰ 91);檢測波長:327 nm;柱溫:30℃;體積流量:1.0 mL/min;進樣量10 μL或20 μL。在此色譜條件下，綠原酸與其他峰可徹底分離，分離度R≥1.5，理論塔板數＞2000。色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)及供試品(B)色譜圖

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品9.32 mg，置50 mL棕色量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2 mL，置20 mL棕色量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含18.64 μg綠原酸)。

2.3 供試品溶液的制備 取消癌平片20片，除去包衣，精密稱定，研細，取0.6 g，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，稱定質量，超聲30 min(功率200 W，頻率40 KHz)，放冷，稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.4 線性關系考察 精密吸取上述綠原酸對照品溶液4、8、12、16、20、24 μL，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以進樣量為橫坐標(X)，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，進行回歸處理，結果綠原酸在0.07456～0.4474 μg范圍內，進樣量與峰面積積分值之間線性關系良好，回歸方程為 Y=3 ×106X+42128，r=0.9997。

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液12 μL，連續進樣5次，測定綠原酸峰面積，結果平均峰面積為6.896×105，相對標準偏差RSD為1.1%。

2.6 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液分別于0、1、2、7、10、15、18 h 進樣，結果綠原酸峰面積的相對標準偏差RSD 為0.5%。

2.7 重復性試驗 取同一樣品，平行制備5份供試品溶液，按上述條件測定，結果綠原酸含量均為0.13 mg/片，相對標準偏差RSD為0%。

2.8 加樣回收率試驗 取重復性試驗項下的樣品5份，分別定量加入綠原酸對照品溶液(18.64 μg/mL)1 mL，揮干，同法提取并測定，計算回收率，分別為96.4%、97.5%、95.0%、98.2%、96.7%，平均回收率為 97%，相對標準偏差RSD 為1.3%。

2.9 樣品測定 取8個廠家共20批次樣品，按上述方法測定，將峰面積代入線性方程，計算綠原酸量，結果見表1:

表1 不同廠家批次樣品中綠原酸測定結果

3 各廠家批次樣品的比較

3.1 各廠家批次樣品的比較 將表1中20批次消癌平片的綠原酸含量輸入SPSS16.0軟件，采用組間均連法，以歐氏距離為指標進行聚類分析，結果如圖2所示，A、B、C、E、F廠家的14批次樣品的綠原酸含量非常接近，與G廠家S17、H廠家S19以及B廠家S5比較接近;G廠家S18、H廠家S20非常接近;D廠家S14綠原酸含量最高，獨立成一類。

圖2 各批次樣品綠原酸含量的聚類分析圖

3.2 穩定性分析 S3與 S4、S10與 S12、S17與 S18、S19與S20均為同廠家同批號樣品，其中第一組內2批次樣品從同一使用單位抽樣，后3組中2批次樣品從不同經營或使用單位抽樣，但前2組內2批次樣品的綠原酸含量相近或相同，后2組內2批次樣品差異很大，聚類分析將其交叉歸類，即S17和S19、S18和S20分別屬于兩類。這可能由于綠原酸的穩定性較差，某些樣品因運輸和貯存條件控制不嚴而導致綠原酸含量降低。

綜合一致性和穩定性結果，按照綠原酸含量由高至低，大致可將上述廠家樣品劃為3個水平，即D＞H-G＞B-F-AC-E。

4討論

各廠家紛紛申請了各自的散頁標準，但規定的檢測項目、方法和含量限度均不一致，導致不同廠家藥品的質量很難保持一致。本文在執行各廠家標準進行法定檢驗的基礎上，摸索了綠原酸和咖啡酸的含量測定方法，在文中所述條件下可同時測定2種成分(圖1)，但因咖啡酸為綠原酸分解后產物，制劑中含量很低(5～10 μg/片)，對于控制和比較制劑質量的意義很小，故本文僅采用聚類分析法比較了各廠家批次樣品綠原酸含量的一致性和穩定性，希望為考察制劑質量的一致性和穩定性提供參考，為制定和完善消癌平片的質量標準提供數據支持。

因中國食品藥品檢定研究院目前只能提供綠原酸和咖啡酸對照品，所以本次研究的指標單一，無法全面反映消癌平片藥效物質基礎，接下來我們將采用HPLC特征圖譜更全面比較各樣品的質量差異，進一步為評價制劑質量和完善質量標準提供依據。

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