口腔鏈球菌密度感應(yīng)信號系統(tǒng)com E基因及l(fā)uxS基因的檢測分析

徐蓉蓉 王斌 葛久禹

（1.南京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔內(nèi)科學(xué)教研室，南京 210008；2.南京大學(xué)生命科學(xué)院 分子進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室，南京 210093）

齦上和齦下牙菌斑的形成是牙齦炎發(fā)生的重要因素，往往導(dǎo)致牙周疾病和齲壞[1]。離散的口腔鏈球菌并不具備致病能力，但當(dāng)它定植于牙面后往往快速繁殖，并通過密度感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）來激發(fā)誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，統(tǒng)一協(xié)調(diào)整個(gè)菌群的行為，使整群細(xì)菌能夠表現(xiàn)出共同的生物學(xué)特性，如形成生物膜、表現(xiàn)出耐酸性、產(chǎn)生細(xì)菌毒素等，從而具備了離散細(xì)菌所不具備的致病能力[1]。由此可見，密度感應(yīng)系統(tǒng)在口腔細(xì)菌的致病過程中發(fā)揮著重要的作用。在口腔鏈球菌中，種內(nèi)的密度感應(yīng)系統(tǒng)由CSP（competence stimulating peptide）信號肽與調(diào)控系統(tǒng)組成，至少包括6個(gè)基因（comA、B、C、D、E、X）[2]。其中comE基因編碼胞內(nèi)反應(yīng)調(diào)控蛋白，負(fù)責(zé)結(jié)合并調(diào)節(jié)下游目標(biāo)基因的表達(dá)，以幫助鏈球菌適應(yīng)牙菌斑內(nèi)高密度的生存環(huán)境[3]。不同鏈球菌種間的密度感應(yīng)信號由另外一類信號分子——自誘導(dǎo)體2（autoinducer-2，AI-2）來傳導(dǎo)。此信號分子的合成途徑已經(jīng)基本確定，其中標(biāo)志性的酶稱為luxS蛋白酶，是luxS基因的編碼產(chǎn)物。luxS蛋白酶參與合成的AI-2同樣可調(diào)控不同口腔細(xì)菌的生理功能和毒力，以適應(yīng)周圍環(huán)境的變化[4-5]。

本實(shí)驗(yàn)將檢測口腔鏈球菌臨床分離株系NH521中是否存在相關(guān)密度感應(yīng)基因comE及l(fā)uxS，并將其基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列進(jìn)行比較，為研究密度感應(yīng)系統(tǒng)的相關(guān)基因在不同口腔鏈球菌種內(nèi)及種間的分化模式和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

基因擴(kuò)增儀（Biometra公司，德國），凝膠電泳儀（上海天能科技有限公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP公司，美國），離心機(jī)（Sigma公司，德國）；細(xì)菌基因組提取試劑盒（杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司），引物合成、基因測序（南京金斯瑞生物科技有限公司），Taq酶及其他聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)試劑（大連寶生物工程有限公司），PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海捷倍思基因技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)菌分離和培養(yǎng)

口腔鏈球菌（Streptococcus oralis）臨床分離株NH521由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研室從牙周病患者口腔菌斑中分離鑒定后提供。采用連續(xù)的厭氧菌培養(yǎng)技術(shù)，將復(fù)蘇48h經(jīng)鑒定為純培養(yǎng)的口腔鏈球菌接種于TSB液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)18 h。

1.3 細(xì)菌DNA的提取

取3mL培養(yǎng)菌液，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒相關(guān)步驟進(jìn)行。所提基因組DNA經(jīng)過凝膠電泳檢測，證實(shí)可用并調(diào)節(jié)至合適的質(zhì)量濃度（20 ng·μL-1）。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中口腔鏈球菌ATCC35037株系的comE及l(fā)uxS基因序列，利用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)引物。其中comE基因的上游引物為：5’-GAAAATGATGAAGTAAACCAG-3’，下游引物為：5’-GAACTTTCAAACGGGTAATCG-3’。luxS基因的上游引物為：5’-TTTTGAACTTGACCACACCA-3’，下游引物為：5’-GCATCATCTGAAATTCCTTG-3’。

1.5 PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系為50μL，其中超純水32.5μL，MgCl24μL，dNTP 4μL，10倍緩沖液5μL，上游、下游引物（10 μmol·L-1）各1μL，Taq酶0.5μL，細(xì)菌基因組DNA 2μL。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃ 4min，變性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。

1.6 基因檢測及測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其片段大小，所采用的DNA分子標(biāo)記為DNA2000 plus（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。純化后的產(chǎn)物DNA由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.7 基因序列比較分析

將從口腔鏈球菌NH521株系中分離得到的comE及l(fā)uxS基因序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中的口腔鏈球菌ATCC35037株系和變異鏈球菌UA159株系中的comE及l(fā)uxS基因序列進(jìn)行Blast比對，分析這2個(gè)基因序列在鏈球菌種內(nèi)和種間的差異程度。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳測定片段大小，如圖1所示。根據(jù)comE基因設(shè)計(jì)的引物預(yù)期擴(kuò)增出一條約570 bp的條帶，而用luxS基因引物預(yù)期擴(kuò)增出一條約435 bp的條帶。這2個(gè)條帶中，comE略大于500 bp標(biāo)記條帶，luxS略小于500 bp標(biāo)記條帶，大小均符合預(yù)期，表明口腔鏈球菌NH521存在comE和luxS基因。

2.2 基因序列測定及比較

將所測定的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的口腔鏈球菌ATCC35037株系以及變異鏈球菌UA159株系中的comE及l(fā)uxS基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果見表1。

表1 com E及l(fā)uxS基因在鏈球菌種內(nèi)和種間的序列一致度比較Tab 1 Comparison of sequence identity within species and between species for com E and luxS genes

luxS、comE基因在口腔鏈球菌種內(nèi)不同株系間的DNA序列一致度分別為95.0%和99.6%，其氨基酸序列均未發(fā)生改變；但對比口腔鏈球菌與變異鏈球菌，luxS基因只有74.1%的DNA序列一致度和84.5%的氨基酸序列一致度，comE基因的DNA序列一致度和氨基酸序列一致度則分別為12.7%和38.4%。

3 討論

牙菌斑是由多種不同種屬細(xì)菌相互之間以及和宿主之間長期相互作用形成的有機(jī)聚生體，是牙周病及齲病的主要病因之一[1]。細(xì)菌種內(nèi)和種間的密度感應(yīng)系統(tǒng)可以調(diào)控菌斑內(nèi)不同致病菌和有益菌的生長競爭、代謝物轉(zhuǎn)化、毒力因子的表達(dá)積累等生物學(xué)行為，從而決定整個(gè)菌群的生存發(fā)展方向與致病能力[6-7]。另外，血鏈球菌、口腔鏈球菌等可以產(chǎn)生過氧化氫，被認(rèn)為是重要的牙周有益菌[8-10]，可能用作效應(yīng)菌定植于口腔，對潛在的可疑致病菌起到有效的拮抗作用。因此，了解口腔鏈球菌相關(guān)密度感應(yīng)基因的存在和分化程度將有助于牙周病的生物防治。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)comE及l(fā)uxS基因序列設(shè)計(jì)引物，提取口腔鏈球菌臨床分離株系NH521的基因組DNA，通過PCR反應(yīng)以及基因測序，直接檢測到實(shí)驗(yàn)菌株中與密度感應(yīng)直接相關(guān)的comE基因和luxS基因的存在。通過與GenBank中口腔鏈球菌ATCC35037株系的相關(guān)基因序列比較發(fā)現(xiàn)：分離得到的新株系NH521在密度感應(yīng)相關(guān)基因comE和luxS的序列上都非常保守。其中氨基酸序列未發(fā)生改變，意味著功能上的一致性。在DNA序列上，luxS基因在2個(gè)口腔鏈球菌株系間呈現(xiàn)出的不同堿基數(shù)，約占整個(gè)基因片段長度的5%；而comE基因在NH521和ATCC35037株系間的不同堿基數(shù)，只占整個(gè)片段長度的0.4%。這表明luxS基因在鏈球菌種內(nèi)更加容易積累變異。將口腔鏈球菌與變異鏈球菌的comE及l(fā)uxS基因序列進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)：luxS基因在2個(gè)物種間還保持了一定的相似性，其中DNA序列的一致度為74.1%，而氨基酸序列的一致度為84.5%。這說明2種鏈球菌在合成種間密度感應(yīng)信號分子AI-2的關(guān)鍵酶（luxS蛋白酶）上仍然比較保守。與此大為不同的是，comE基因在2個(gè)物種間的序列一致度很低，其中DNA序列一致度僅為12.7%，而氨基酸序列的一致度也不到40%。這說明用于傳遞各自種內(nèi)密度感應(yīng)信號CSP的comE基因產(chǎn)物（胞內(nèi)反應(yīng)調(diào)控蛋白）已經(jīng)在不同鏈球菌物種間發(fā)生了很高程度的分化，并且luxS基因在種內(nèi)不同株系間比comE基因積累了更多變異，而comE基因在不同鏈球菌物種間卻更加分化。由于comE基因編碼的胞內(nèi)反應(yīng)調(diào)控蛋白負(fù)責(zé)結(jié)合并調(diào)控許多下游基因的表達(dá)，不同鏈球菌物種間comE基因序列的巨大差異暗示了在不同種間被調(diào)控的下游基因在組成和表達(dá)上都可能存在較大的差異，從而表現(xiàn)出生理、生化以及功能上的差異。

本研究在一定程度上揭示了口腔鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)的相關(guān)基因在種內(nèi)和種間的分化程度差異，為研究菌群中相關(guān)口腔細(xì)菌的分化模式和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，今后將進(jìn)一步研究這2種密度感應(yīng)基因的功能。

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