幽門螺桿菌口腔定植和胃腸疾病的關聯性研究

陳駿 何祥一 吳凌莉 車團結

（1.蘭州大學口腔醫學院 口腔修復教研室；2.蘭州大學 生命科學院細胞生物學研究所，蘭州 730000）

自從Marshall等[1]從胃黏膜上分離培養出幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）以來，H.pylori的研究已取得了突破性的進展，已證實其是各型慢性胃炎的主要病原體，并且是胃癌的早期危險因素[2]。H.pylori主要定居在胃黏膜上，但其傳播途徑尚不明了。Krajden等[3]從口腔中分離出H.pylori，證實了口腔內有H.pylori的定植和寄居，并且是人體H.pylori的第二儲菌庫。牙周健康狀況與H.pylori的定植關系密切[4]，牙周病患者牙菌斑的酸性微生態環境，牙周袋內較低的氧化還原電位，都為H.pylori提供了理想的生存環境。口腔中的H.pylori可以隨唾液源源不斷地被吞咽到胃中，這可能是胃病復發的重要因素[5-8]，Young等[9]研究發現口腔中的H.pylori和胃內的H.pylori在形態學上并沒有區別，其生化特性和免疫特性也相似。彭惠等[10]檢測發現胃黏膜與唾液中H.pylori的2種vacA基因型的一致率為98%。但也有學者認為H.pylori在口腔中的存在是一過性的，口腔與胃內H.pylori感染無明顯相關性[11-12]。

本研究采用細菌培養的方法，通過唾液檢測胃腸疾病患者口腔中的H.pylori，進一步分析、探討口腔中H.pylori的定植與年齡、性別、牙周狀況及不同胃腸疾病的關聯性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 胃腸疾病組 選取2009年11月—2010年4月間因上消化道癥狀在甘肅省白銀市第一人民醫院消化內科接受胃鏡檢查且被確診為胃腸道疾病的173名患者為研究對象。其中男性73人，女性100人。年齡為15～78歲，65歲及以上15人，45～64歲67人，35～44歲55人，35歲以下36人。消化性潰瘍23人；糜爛性胃炎18人；淺表性胃炎92人；返流性胃炎28人；萎縮性胃炎9人；其他3例，包括胃癌2例及疣狀胃炎1例。根據WHO的社區牙周指數（community periodontal index，CPI）分值，牙周健康13人，牙齦出血37人，牙結石101人，牙周袋22人。所有患者3個月內未服用抗生素及鉍劑或質子泵抑制劑等胃藥，12個月內未接受過牙周治療，全口牙不少于24顆，否認患有其他重要系統性疾病。

1.1.2 對照組 選取在甘肅省白銀市第一人民醫院口腔科接受口腔檢查、無消化道癥狀的128人為對照。其中男性48人，女性80人；年齡23～60歲。

1.2 取樣和檢查

胃鏡檢查前，當日清晨空腹采用吐唾法收集胃腸疾病患者的全唾液。取樣前用生理鹽水漱口，讓受檢者將唾液吐入事先準備好的無菌塑料試管中，2～5mL，立即放在-80℃低溫冰柜儲存，備用。然后根據CPI進行牙周檢測，使用統一的平面口鏡和WHO推薦的CPI探針，從每例患者口腔內選擇6個區段，共10個指數牙（20歲以下檢查6個指數牙）。記錄CPI指數及每位患者的基本資料。唾液樣本及臨床檢查全部由一位具有5年以上工作經驗的口腔本科畢業的醫師完成。

1.3 診斷標準

每個區段以最重情況的指數牙記分，6個區段中最高記分為個人CPI分值。具體標準如下。0：牙齦健康；1：牙齦炎，探診后出血；2：探診可發現牙石，齦袋深度＜3.5mm；3：早期牙周病，齦袋深度4～5mm；4：晚期牙周病，牙周袋深度在6mm或以上。

1.4 H.pylori的培養和鑒定

1.4.1 混合抗生素 稱取萬古霉素0.016 g、兩性霉素B 0.016 g、多黏菌素0.000 6 g，將其在紫外線下照射1 h，均勻混合。再稱取甲氧芐胺嘧啶0.008 g，溶于10mL蒸餾水中，并加乳酸一滴，煮沸10min，將混合抗生素加入，用滅菌蒸餾水加至40mL，混勻，4℃保存，備用。

1.4.2 培養基 將5.2 g腦心浸液瓊脂粉加入100mL去離子水中，微波爐加熱，配成100mL腦心浸液瓊脂，取15mL待溫度降至45～50℃時加入脫纖維綿羊血0.8mL和混合抗生素0.4mL，將pH值調至7.5，倒入24孔培養板，冷卻。

1.4.3 培養 吸取0.01mL唾液，滴于固體培養基，用接種環涂開，將培養平板置于密閉玻璃干燥器內，用抽氣泵抽至負壓73 kPa后，灌入氣體使終濃度分別達到5%O2、85%N2、10%CO2，保持濕度＞95%，37 ℃電熱恒溫培養箱內培育1～4 d，觀察H.pylori生長情況。

1.4.4 鑒定 刮取一環細菌置入尿素酶試劑中，37℃、1min后，試劑變成紅色或紫紅色為陽性（尿素酶實驗）；在一張載玻片上滴加3%H2O2液，刮取一環菌落置入后，可以見到連續不斷的氣泡生成（觸酶試驗）；刮取菌落放置在浸有氧化酶試劑的濾紙上，在接觸部位出現深藍黑色（氧化酶試驗）。經以上3種實驗鑒定，結果均為陽性，可證明H.pylori高質量培養成活，以排除來自口腔的其他相似細菌。

1.5 統計學方法

采用SPSS16.0軟件包對實驗數據進行處理，對各組結果的差異性采用χ2檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 H.pylori的培養和鑒定結果

經肉眼觀察菌落呈凸起圓形，半透明，邊緣整齊，光滑，灰白色，直徑為1.5～8.0mm。普通顯微鏡下觀察H.pylori為海鷗狀、S狀彎曲菌，革蘭染色為陰性。用無菌接種環取菌落，置于尿素酶試劑盒中，2min內試劑由黃色變為紅色，觸酶試驗及氧化酶試驗結果均為陽性（圖1）。

2.2 唾液中H.pylori的檢測

173例胃腸疾病患者口腔唾液中H.pylori陽性率為40.46%（70/173），128例對照組患者口腔唾液中H.pylori陽性率為43.75%（56/128），2組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 口腔中H.pylori感染與胃腸疾病的關系

在萎縮性胃炎組H.pylori陽性率為77.78%（7/9），明顯高于淺表性胃炎組36.96%（34/92）和消化性潰瘍組26.09%（6/23），且差異有統計學意義（P＜0.05）。在糜爛性胃炎組H.pylori陽性率為61.11%（11/18），與消化性潰瘍組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 性別及年齡因素對口腔中H.pylori感染的影響

在173例胃腸疾病患者中，男性H.pylori陽性率為49.32%（36/73），女性H.pylori陽性率為34.00%（34/100），男性高于女性，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中45～64歲年齡組H.pylori陽性率為56.72%（38/67），明顯高于35～44歲年齡組30.91%（17/55）及35歲以下年齡組19.44%（7/36），差異有統計學意義（P＜0.05）。2.5 H.pylori陽性率與牙周狀況之間的相關關系

牙周健康組、牙齦出血組、牙結石組、牙周袋組H.pylori陽性率分別為15.38%（2/13）、24.32%（9/37）、42.57%（43/101）、72.73%（16/22）。牙周健康組H.pylori陽性率與牙周袋組H.pylori陽性率相比，其差異有統計學意義（P＜0.05）。口腔中H.pylori的檢出率與患者口腔牙周疾病的嚴重程度呈正相關。

3 討論

H.pylori感染是常見的慢性感染性疾病，全世界約有50%的人群感染H.pylori。長期以來，多數學者認為H.pylori僅寄居于人類，且胃是其惟一的生存環境，只在人與人間傳播[3，13-14]。Tursi等[15]提出H.pylori的傳播方式主要有糞—口、口—口、胃—口、胃—胃。可見口腔在H.pylori傳播中占據重要地位，但其傳播方式仍不明確。而口腔作為人體的重要“菌庫”之一，唾液中的微生物主要來自黏膜、舌背、牙菌斑和齦溝等處，牙菌斑及牙周袋又是H.pylori聚集的主要區域。Miyabayashi等[16]認為口腔與胃內的H.pylori具有同源性。在臨床上消化科采用三聯療法治療由H.pylori感染引起的胃、十二指腸炎性病變，但是病變復發和再次感染H.pylori常給醫務工作者和患者帶來困擾，其原因可能是口腔中H.pylori隨唾液源源不斷地被吞咽到胃，藥物能清除胃腸消化道的H.pylori感染，但對唾液中的H.pylori清除效果不明顯[17]。有學者[18-20]采用聚合酶鏈反應檢測患者口腔及胃內的H.pylori菌株，發現兩者截然不同，認為H.pylori只是暫時存留于口腔，對胃H.pylori感染不起主要作用。也有學者[11-12，19，21]認為H.pylori是一種條件致病菌，廣泛存在于健康人和慢性胃炎患者的口腔內，一般不會致病，當環境改變時才導致胃病的發生。

本研究利用細菌培養法，結合氧化酶、快速尿素酶和觸酶試驗對H.pylori進行檢測和鑒定。細菌培養法是H.pylori檢測的“金標準”之一，尤其快速尿素酶檢測方法簡單，費用低，診斷速度快，是臨床上最常用的診斷方法之一。本研究對173例胃腸疾病患者唾液中的H.pylori進行檢測，H.pylori陽性率為40.46%，對照組H.pylori陽性率為43.75%，說明H.pylori廣泛存在于健康人和胃腸疾病患者的口腔內，是一種條件致病菌。在不同胃腸疾病患者的口腔唾液中，將H.pylori陽性率進行比較發現，萎縮性胃炎組最高，為77.78%，糜爛性胃炎組為61.11%，表明患者口腔H.pylori感染與萎縮性胃炎和糜爛性胃炎間存在密切的相關性。

不同年齡性別分組中，性別差異顯著。男性的口腔自我保健意識較女性薄弱，無良好的口腔衛生和就醫習慣。較差的牙周狀況、腫脹的牙齦以及粗糙的牙石表面，都為H.pylori在口腔中定植和致病提供了有利條件，45～64歲中年組H.pylori陽性率為56.72%，明顯高于低年齡組（P＜0.05），使口腔中的H.pylori成為胃腸道疾病發生的重要隱患。

在以CPI分值分組的4組患者中，牙周袋組患者H.pylori陽性率高達72.73%，明顯高于其余3組，提示口腔中H.pylori的陽性率可能與患者口腔牙周疾病的嚴重程度呈正相關，甚至成為胃腸道疾病發生及復發的重要原因。牙周病患者牙周袋內有大量的牙菌斑、軟垢、牙石、食物殘渣、炎癥性滲出液，這些物質為口腔中H.pylori的定植提供了適宜的溫度、濕度、酸堿度及營養等環境；牙周袋的深度為H.pylori的生存提供了良好微生態環境及一定的保護，使牙周袋成為H.pylori的永久聚集地。

綜上所述，H.pylori廣泛存在于健康人和胃腸疾病患者的口腔內，是一種條件致病菌。本研究結果豐富了牙周疾病與全身疾病之間的關系，提示控制牙周疾病可能是預防胃黏膜H.pylori再感染的重要措施之一。口腔中H.pylori的來源、致病機制以及與胃內H.pylori感染的關系，尚需更深入的基礎和臨床研究。

[1]Marshall BJ,Warren JR.Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration[J].Lancet,1984,323（8390）：1311-1315.

[2]Tokunaga Y,Shirahase H,Hoppou T,et al.Density of Helicobacter pylori infection evaluated semiquantitatively in gastric can-cer[J].J Clin Gastroenterol,2000,31（3）：217-221.

[3]Krajden S,Fuksa M,Anderson J,et al.Examination of human stomach biopsies,saliva,and dental plaque for Campylobacter pylori[J].J Clin Microbiol,1989,27（6）：1397-1398.

[4]Madinier IM,Fosse TM,Monteil RA.Oral carriage of Helicobacter pylori：A review[J].J Periodontol,1997,68（1）：2-6.

[5]Jiang C,Li C,Ha T,et al.Identification of H.pylori in saliva by a nested PCR assay derived from a newly cloned DNA probe[J].Dig Dis Sci,1998,43（6）：1211-1218.

[6]Tiwari SK,Khan AA,Ahmed KS,et al.Rapid diagnosis of Helicobacter pylori infection in dyspeptic patients using salivary secretion：A non-invasive approach[J].Singapore Med J,2005,46（5）：224-228.

[7]Li C,Ha T,Ferguson DA Jr,et al.A newly developed PCR assay of H.pylori in gastric biopsy,saliva,and feces.Evidence of high prevalence of H.pylori in saliva supports oral transmission[J].Dig Dis Sci,1996,41（11）：2142-2149.

[8]Song Q,Lange T,Spahr A,et al.Characteristic distribution pattern of Helicobacter pylori in dental plaque and saliva detected with nested PCR[J].JMed Microbiol,2000,49（4）：349-353.

[9]Young KA,Allaker RP,Hardie JM.Morphological analysis of Helicobacter pylori from gastric biopsies and dental plaque by scanning electron microscopy[J].Oral Microbiol Immunol,2001,16（3）：178-181.

[10]彭惠,潘國宗,曹世植,等.在唾液中檢測幽門螺桿菌的意義[J].中華內科雜志,1999,38（3）：171-173.Peng Hui,Pan Guozong,Cao Shizhi,et al.The significance of detection of Helicobacter pylori in saliva[J].Chin J Intern Med,1999,38（3）：171-173.

[11]Czesnikiewicz-Guzik M,Karczewska E,Bielanski W,et al.Association of the presence of Helicobacter pylori in the oral cavity and in the stomach[J].J Physiol Pharmacol,2004,55（Suppl 2）：105-115.

[12]Czesnikiewicz-Guzik M,BielanskiW,Guzik TJ,et al.Helicobacter pylori in the oral cavity and its implications for gastric infection,periodontal health,immunology and dyspepsia[J].J Physiol Pharmacol,2005,56（Suppl 6）：77-89.

[13]Umeda M,Kobayashi H,Takeuchi Y,et al.High prevalence of Helicobacter pylori detected by PCR in the oral cavities of periodontitis patients[J].J Periodontol,2003,74（1）：129-134.

[14]Dowsett SA,Kowolik MJ.Oral Helicobacter pylori：Can we stomach it[J].Crit Rev Oral Biol Med,2003,14（3）：226-233.

[15]Tursi A,Cammarota G,Papa A,et al.The modes of transmission of Helicobacter pylori infection[J].Recenti Prog Med,1997,88（5）：232-236.

[16]Miyabayashi H,Furihata K,Shimizu T,et al.Influence of oral Helicobacter pylori on the success of eradication therapy against gastric Helicobacter pylori[J].Helicobacter,2000,5（1）：30-37.

[17]Nguyen AM,el-Zaatari FA,Graham DY.Helicobacter pylori in the oral cavity.A critical review of the literature[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,1995,79（6）：705-709.

[18]Czesnikiewicz-Guzik M,Loster B,Bielanski W,et al.Implications of oral Helicobacter pylori for the outcome of its gastric eradication therapy[J].J Clin Gastroenterol,2007,41（2）：145-151.

[19]Loster BW,Majewski SW,Czesnikiewicz-Guzik M,et al.The relationship between the presence of Helicobacter pylori in the oral cavity and gastric in the stomach[J].J Physiol Pharmacol,2006,57（Suppl 3）：91-100.

[20]Kabir S.Detection of Helicobacter pylori DNA in feces and saliva by polymerase chain reaction：A review[J].Helicobacter,2004,9（2）：115-123.

[21]Song Q,Haller B,Schmid RM,et al.Helicobacter pylori in dental plaque：A comparison of different PCR primer sets[J].Dig Dis Sci,1999,44（3）：479-484.