FHL2蛋白在人牙周膜細胞體外礦化過程中的表達

王璐 葛少華 王效英 楊丕山

（山東大學口腔醫學院·山東省口腔生物醫學重點實驗室，濟南 250012）

FHL家族蛋白是指由4個半LIM結構域組成的一類蛋白質，它們只含LIM結構域，是LIM-only家族的一部分。近年來研究發現，該家族中FHL2蛋白在成骨細胞分化中起著重要作用。在胞核內，FHL2可作為輔助催化劑與轉錄因子相互作用；在細胞質內，FHL2可與許多整合素結合傳遞和放大細胞信號。FHL2蛋白過表達可提高成骨分化標志物產生和基質礦化；反之，FHL2減少會抑制成骨細胞分化，降低骨形成量[1]。但FHL2在牙周膜細胞礦化過程中的作用尚未見相關報道。與成骨細胞一樣，牙周膜細胞由間充質組織發育而來，且在一定條件下均有合成及分泌胞外膠原基質發生礦化的能力。由于牙周膜細胞與成骨細胞在功能和特征上有很多相似之處，故推測FHL2在牙周膜細胞可能有表達，且在分化、礦化中發揮一定作用。目前已知可以先體外培養牙周膜細胞，然后加入地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉等之后則建立了牙周膜細胞體外礦化模型[2-3]。本研究以人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）為研究對象，建立體外礦化模型，利用免疫細胞化學技術、半定量RT-PCR技術研究FHL2在牙周膜細胞體外分化、礦化過程中的表達。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

高糖DMEM（Gibco公司，美國），β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松（Sigma公司，美國），TRIzol（大連寶生物有限公司），RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本），FHL2多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國），SP、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 標本取自臨床上10～18歲青少年因正畸治療而拔除的健康前磨牙，無菌條件下刮取根中1/3的牙周膜，組織塊法培養，每隔3 d換液1次。培養液為含15%胎牛血清、青霉素100U·mL-1、鏈霉素100μg·mL-1的DMEM培養液。取3～5代牙周膜細胞進行研究。實驗組培養液中加入10mmol·L-1β-甘油磷酸鈉，50 μg·mL-1維生素C，5mol·L-1地塞米松液進行牙周膜細胞體外礦化誘導；對照組不加上述礦化誘導劑。

1.2.2 茜素紅染色檢測礦化結節形成 取第4代牙周膜細胞以每毫升5×104個細胞密度接種于24孔板中的小蓋玻片上，分別礦化培養0、14、28 d，將細胞爬片取出，40 g·L-1多聚甲醛固定液固定30min，蒸餾水沖洗，加入茜素紅染料，染色20min，沖洗。封片。顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫細胞化學法檢測FHL2蛋白表達 分別于礦化培養0、14 d，將預先置入孔板的細胞爬片取出，40 g·L-1多聚甲醛固定15min，按照SP試劑盒說明書行免疫細胞化學染色。一抗比例1∶100，DAB顯色，沖洗，蘇木素復染，封片。鏡下觀察。

1.2.4 RT-PCR檢測FHL2 mRNA表達 分別于培養的0、14、28 d提取細胞總RNA。細胞瓶中加入TRIzol試劑，移液器反復吹打后移入Eppendorf管。室溫放置5min，加三氯甲烷振蕩后靜置。4℃，12 000 g離心15min，吸取上層水相至新Eppendorf管。依次加異丙醇、75%乙醇沉淀、洗滌RNA。沉淀中加入RNasefree水，70℃水浴10min。用逆轉錄酶、引物Oligo（dT）將所得RNA在50℃水浴60min，70℃水浴15min的反應條件下逆轉錄為cDNA。FHL2的上游引物為3’-ACTGCTTCTGTGACTTGTATGC-5’，下游引物為3’-GTTATGCCACTGCCGTTCC-5’。PCR反應條件為94℃預變性5min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，32個循環；72℃末次延伸7min。PCR產物通過1.5%凝膠電泳與DL2000 DNA Marker對照鑒定大小，凝膠成像系統拍照。以內參甘油醛-3-磷酸脫氫（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為標準，分別對hPDLCs誘導后各期PCR產物條帶做吸光度值分析，分析FHL2 mRNA表達。

1.2.5 統計分析 每組實驗重復4次。所有數據均使用SPSS11.0軟件包進行統計學單因素方差分析。

2 結果

2.1 細胞生長和形態

原代培養獲得體外生長的比例為10%～20%，一般3～7 d組織塊邊細胞開始游出，呈成纖維細胞狀（圖1），以組織塊為中心呈放射狀、漩渦狀生長。傳代后4～7 d可長滿瓶底。

2.2 礦化結節形成

0 d時基本無礦化結節形成，14 d時茜素紅染色顯示有散在的礦化點或小的礦化結節形成，28 d時顯示有明顯的紅色礦化結節形成（圖2），散在分布，周圍為緊密排列的hPDLCs，生長中心處結節較多。對照組則礦化結節形成較少且相對滯后。

2.3 FHL2蛋白表達

免疫細胞化學結果顯示：培養14 d，實驗組FHL2蛋白在牙周膜胞核與細胞質均呈強陽性表達（圖3），而對照組也為陽性表達，但與實驗組相比較弱（圖4）。

2.4 FHL2 mRNA表達

RT-PCR檢測在hPDLCs體外礦化過程中，FHL2 mRNA表達的電泳結果見圖5。FHL2 mRNA表達量用其與管家基因GAPDH的比值表示。在進行礦化誘導之前，hPDLCs中FHL2 mRNA的表達量為0.810 9，經礦化誘導14 d,FHL2 mRNA的表達量顯著升高，達到1.1266，約為0d時的1.4倍（P＜0.01）；而經礦化誘導28 d后，FHL2 mRNA的表達量與14 d時相比有顯著降低（P＜0.05），為1.015 4，但仍然顯著高于0 d時的水平（P＜0.01）。

3 討論

牙周膜細胞具有多向分化能力，是牙周組織工程中最重要的種子細胞之一。組織工程學研究顯示，由牙周膜細胞形成的牙周膜-牙骨質復合體在組織形態和空間排列上更類似于天然牙周組織[4]，表明其在牙周組織再生方面具有其他種子細胞不具備的優勢。牙周再生的關鍵過程是牙周膜細胞通過向成骨細胞及成牙骨質細胞方向分化，形成礦化組織（骨和牙骨質），因此，研究牙周膜細胞分化和礦化機制及其中涉及的信號分子對牙周組織工程具有極其重要的作用。

研究[2-3]證明：在培養液中加入礦化劑β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松，可誘導體外培養的牙周膜細胞形成礦化結節。在本研究中，將hPDLCs進行體外礦化誘導培養，14 d后礦化結節形成，茜素紅染色呈陽性。因體外礦化結節的形成是成骨細胞分化成熟的標志，故該結果表明經礦化誘導后，牙周膜細胞已向成骨方向分化。在這一體外分化過程中，細胞內信號轉導分子FHL2在牙周膜細胞中的表達也發生了相應的改變。

FHL2蛋白是隸屬于FHL家族的信號轉導分子。近年來發現，FHL2在成骨細胞中大量表達[5-6]。研究[7]表明：在骨髓細胞向成骨細胞分化時，FHL2表達量可增加3倍，且FHL2蛋白表達量的改變可對成骨細胞的生物學特性產生明顯影響，FHL2高表達的成骨細胞分化標志物如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）等均呈上調趨勢，且骨基質礦化也同時升高；相反，FHL2缺乏的成骨細胞呈現減低的分化趨勢[5]。其機制目前認為主要包括FHL2在蛋白水平能與多種蛋白相互作用，如與胰島素樣生長因子結合蛋白-5（insulin-like growth factor binding protein-5，IGFBP-5）相互作用，并且FHL2可能作為IGFBP-5的輔助激活劑來刺激成骨細胞增殖[6]；同時在分子水平，FHL2作為轉錄因子共激活劑與Runx2相互作用，通過成骨細胞內FHL2活性改變使骨量發生相應改變[1]。此外，FHL2還可調節細胞周期。Lai等[5]提出，FHL2過表達的成骨細胞7 d后增殖率明顯高于普通細胞，使得細胞層匯合加快。因此，通過介導多種蛋白間相互作用，FHL2對成骨細胞分化和活性均具有著明確的促進作用。

本研究免疫細胞化學結果顯示：牙周膜細胞礦化誘導14 d后FHL2蛋白表達量明顯增高，提示其表達量與礦化相關。為了深入探討hPDLCs礦化誘導時間與FHL2表達量間的關聯，本實驗通過RT-PCR實驗來檢測FHL2基因水平的改變。結果表明FHL2 mRNA的表達量在礦化14 d時升高至0 d時的1.4倍，而到28 d時有所降低。該結果說明從分子水平上FHL2在牙周膜細胞與成骨細胞表達情況相似，即早期礦化成骨過程中FHL2表達量增高明顯。Hamidouche等[8]的實驗結果也表明：骨髓基質干細胞在經地塞米松礦化誘導3 d后，即有FHL2的表達增加，同時相應的伴有Runx2、ALP及Ⅰ型膠原表達的增加。從以往的研究已知，Runx2在細胞礦化分化早期中的作用比在晚期更為明顯，因此，本實驗中FHL2表達變化趨勢與該研究的結果相一致。

研究表明：FHL2分子可能以一種Rho/GTP酶依賴的方式自細胞質轉移進胞核內[9-10]，且FHL2蛋白的相對分子質量為3.2×104，而主動運輸方式通過核孔的相對分子質量上限為5.0×104，因此，FHL2可以在缺乏核定位信號和核輸出信號的情況下出入細胞核。雖然已知FHL2的編碼蛋白為核漿分布，但其亞細胞結構定位仍具有細胞特異性。如HeLa細胞、原成肌細胞等主要位于細胞核內，而在HepG2、H9C2、成纖維細胞等其他類型細胞中則胞核及細胞質均有分布[11-12]。FHL2蛋白這種在細胞質及胞核均有分布的特性在本研究中也得以體現。免疫細胞化學結果顯示：牙周膜細胞礦化前后FHL2均為胞核及細胞質陽性表達，這種表達符合FHL2蛋白在成纖維類細胞的定位特點。

牙周組織的修復與再生過程涉及大量信號分子，其中既包括增強牙周膜細胞增殖活性的信號分子，也包括促進牙周膜細胞遷移分化等功能活動的細胞分子，因此選擇合適的信號分子對于牙周組織工程來說至關重要。進一步的實驗將在深入探討FHL2在牙周膜細胞礦化過程中作用機制的基礎上，研究FHL2應用于牙周硬組織再生的可行性。

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