牛體外性控胚胎的移植效果觀察

鄭新寶,劉 宏,陳靜波,蔣曉新,丁 鳳,孫杰敏,于 明

(1.新疆畜牧科學院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆哈密奧科畜牧生物科技有限責任公司，新疆 哈密 839000)

性別控制技術是通過人為干預使動物按人們所需的性別繁衍后代的技術。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中有選擇地繁殖理想性別的后代將大大提高畜群繁育的數(shù)量和生產(chǎn)性能改良的速度，從而可以節(jié)省大量的時間、精力和費用[1]。

流式細胞分類儀(Flow cytometer)利用動物X和Y精子DNA含量存在的差異，實現(xiàn)對X和Y精子的分離。自Johnson等(1989年)首先報道利用流式細胞分類儀成功分離出兔的X和Y精子，并用分離精子授精產(chǎn)下后代以來，該技術的研究取得實質性進展，已成為目前分離動物精子最可靠的方法[2]。用分離的X精子體外受精、體外培養(yǎng)、玻璃化冷凍等技術結合生產(chǎn)的性控胚胎已經(jīng)進入市場。筆者在新疆哈密進行了較大規(guī)模的體外性控胚胎移植嘗試，取得了較為理想的效果。

1 材料和方法

1.1 受體母牛

選擇健康無病，發(fā)育良好，中等膘情，且有正常發(fā)情周期的南陽牛和新疆本地土雜種牛2 400頭作為受體母牛。

1.2 體外性控胚胎

購入常規(guī)冷凍和玻璃化冷凍兩種性控胚胎。

1.3 藥液

解凍液、移植液、血清等；PG(氯前列醇鈉)，0.2mg(2ml)/支（上海計劃生育研究所生產(chǎn)），靜松靈、利多卡因。

1.4 器械

體視顯微鏡、移植器、四孔培養(yǎng)器、培養(yǎng)箱。

1.5 受體牛的同期處理

用PG處理，直檢一側卵巢有功能性黃體的空懷牛，肌注劑量為0.4～0.6mg/頭·次。對同期處理發(fā)情牛群和自然發(fā)情牛群，每群每天至少早晚各觀察1次發(fā)情，每次至少15min以上，以接受爬跨為發(fā)情標志[3]。

1.6 常規(guī)和玻璃化冷凍體外性控胚胎的解凍

1.6.1 胚胎解凍液的準備 吸取3mL移植液，再吸取0.3mL血清，置于一次性培養(yǎng)皿中；取4孔板，吸取適量常規(guī)冷凍胚胎解凍液分別置于1號、2號、3號、4號孔；將培養(yǎng)皿、四孔板置于39℃恒溫板上備用。

1.6.2 胚胎解凍方法 常規(guī)冷凍體外性控胚胎解凍方法：從液氮罐中取出胚胎細管，在空氣中停留5 s，放入盛有35℃純凈水的解凍槽中，停留30 s取出。將細管兩端消毒后剪開，將胚胎依次移入1號、2號、3號、4號孔中，在39℃恒溫環(huán)境中各放置5min。將胚胎移入盛有移植液的培養(yǎng)皿中，鑒定級別，裝管移植。

玻璃化冷凍體外性控胚胎的解凍方法：用鑷子從液氮罐中取出細管，在裝有胚胎的液段還沒有離開液氮面時，用食指按住上端開口取出胚胎管，立刻將含液段的一端放入1號孔中，這時液體將自動流入1號孔中。核對1號孔中胚胎數(shù)并記錄。將胚胎依次移入2號、3號、4號孔中，在39℃恒溫環(huán)境中放置5min。將胚胎移入盛有移植液的培養(yǎng)皿中，鑒定級別，裝管移植。

1.6.3 胚胎鑒定 按照胚胎等級標準將解凍后的可用胚胎分為A、B、C 3個級別，胚胎分別裝管，標記和記錄。

1.7 胚胎移植

以發(fā)情受體牛接受爬跨當日計為第0天，在發(fā)情第7天，檢查受體牛。黃體側卵巢基部充實、有彈性，黃體直徑≥1.0 cm，可作為合格受體牛進行移植。將胚胎細管裝入移植槍，套上移植外鞘、軟護膜，然后采用非手術法移入受體牛有黃體側子宮角大彎或更深部位[3]。

1.8 妊娠檢查與妊娠母牛管理

移植過的受體牛單獨組群集中飼養(yǎng)管理，在移植后50～70 d，用B超或直檢對受體牛進行妊娠檢查。在移植90 d以后，再次對妊娠牛進行復檢，以確定最終妊娠結果。

經(jīng)檢查確診妊娠的受體牛，分群單獨管理，供給充足的飼草飼料以保證滿足胎兒和母體的營養(yǎng)需求；注意采取措施防止妊娠牛之間互相頂架、擠撞、滑倒等以避免流產(chǎn)發(fā)生。

2 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

建立數(shù)據(jù)庫，以移植后50～70 d的妊娠率為技術指標，用生物統(tǒng)計學分析法，得出結果分析。

3 結果與討論

3.1 體外性控胚胎冷凍方法對妊娠率的影響

使用常規(guī)冷凍法胚胎移植受體牛747頭次，妊娠218頭，受胎率為29.2%；使用玻璃化冷凍的體外性控胚胎，移植受體牛1 454頭次，妊娠510頭，受胎率為35.1%，受胎率有明顯提高(P＜0.01)。

表1 不同冷凍方法體外牛胚胎的妊娠結果對比

3.2 胚胎級別對妊娠率的影響

移植常規(guī)冷凍胚胎的受體牛為747頭次，其中移植A級體外性控胚胎260頭次，受胎率為35%；移植B級體外性控胚胎458頭次，受胎率為26.8%；移植C級體外性控胚胎29頭次，受胎4頭。A級體外性控胚胎的受胎率比B級的有明顯提高(P＜0.01)。

表2 常規(guī)冷凍法胚胎解凍后級別與妊娠結果的關系

移植玻璃化冷凍胚胎1 454頭次，其中移植A級的體外性控胚胎1 013頭次，受胎率37.4%；移植B級的體外性控胚胎390頭次，受胎率30.0%；移植C級的體外性控胚胎51頭次，受胎率27.5%。A級體外性控胚胎的受胎率比B級的有明顯提高(P＜0.01)。

表3 玻璃化冷凍法胚胎解凍后級別與妊娠結果的關系

玻璃化冷凍胚胎中A級胚胎的比率大，表明玻璃化冷凍方法對胚胎的損傷程度較小。同時其A級、B級、C級胚胎的受胎率均高于常規(guī)冷凍胚胎的受胎率，表明玻璃化冷凍胚胎的質量要優(yōu)于常規(guī)冷凍胚胎。質量較好的胚胎總是能獲得較高的受胎率。

3.3 不同黃體鑒定方法對妊娠率的影響

利用B超儀對受體牛的黃體進行測定，并對測定結果中黃體直徑≥1.0 cm的129頭受體牛進行了移植，妊娠36頭，受胎率為27.9%，相對于直腸檢查鑒定黃體，受胎率并無明顯變化。利用B超儀對受體牛的黃體進行測定的優(yōu)點是比較直觀，可以在圖像上確定黃體的直徑大小；而直檢則比較方便、快捷，不僅可以大致判斷黃體直徑大小，而且可以根據(jù)手感判斷黃體的質地和彈性，確定受體牛的黃體現(xiàn)狀。

表4 使用不同黃體鑒定方法對移植結果的影響

3.4 體外性控胚胎產(chǎn)母犢率的結果

在新疆哈密累計移植體外性控胚胎2 201頭次，妊娠728頭次。由于時間限制，對其中357頭出生犢牛的性別進行了統(tǒng)計，結果顯示：有345頭犢牛為母犢，母犢率為96.6%，性別比例效果可靠。

3.5 體外性控胚胎妊娠后流產(chǎn)及出生死亡情況

在移植后50～70 d，用B超對受體牛進行妊娠檢查，確定有728頭妊娠。在移植90 d以后，再次對妊娠牛進行復檢，妊娠結果為625頭妊娠，有14.1%的妊娠消失。另外，在出生的犢牛中，有一些牛出現(xiàn)了難產(chǎn)現(xiàn)象和犢牛早期死亡，還有個別畸形牛出生，如無肛門、腹部皮膚未愈合、后軀多出一個后肢等。

4 小結

通過以上實驗及分析認為，在規(guī)模化的體外性控胚胎移植過程中，玻璃化冷凍胚胎取得了較為理想的受胎結果，胚胎質量、性控比例也有很高的水平，為此項高科技產(chǎn)品的推廣打下了良好的基礎。同時，在妊娠牛的飼養(yǎng)管理、犢牛接生、犢牛護理及早期培育等眾多環(huán)節(jié)上，還有大量的工作要做。

[1] 盧克煥.分離精子及其在畜牧業(yè)中初步的應用[C].中國奶業(yè)協(xié)會第19次繁殖技術研討會論文集.

[2] 余榮，楊利國.奶牛性別控制研究進展[C].中國奶業(yè)協(xié)會第19次繁殖技術研討會論文集.

[3] 陳靜波.牛冷凍精液與胚胎移植技術問答.