重組山羊FSH基因在畢赤酵母中的高效表達

楊歡利,毛英姿,丁家桐

(1.浙江省臺州醫院 生殖中心，浙江 臺州 317000；2.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

促卵泡素(FSH)是一種糖蛋白激素，對配子的發生、分化、成熟及與生殖有關行為的發生都起著重要的作用。在動物生殖過程中FSH與LH協同作用可促使雄性動物生精上皮發育和精子成熟，并可促使雌性動物卵泡成熟、抑制卵泡閉鎖、誘導芳香酶活性、刺激顆粒細胞增生及誘導促黃體素(LH)和催乳素(PRL)受體產生[1]。

目前，動物生產中用的FSH主要從各種家畜腦垂體組織純化而來的，垂體提取的FSH純度低，生物活性不穩定，而且常不同程度地混雜有LH及其它潛在傳染性病原[2],其負作用較大,影響了FSH的廣泛應用。利用基因工程可獲得純度較高的且不含LH的重組促卵泡素，而且生物活性穩定[3,4]。重組FSH的應用，可以改善超數排卵的效果，增加結果的可預見性，并且能夠優化超排的程序。

巴斯德畢赤酵母表達系統是被廣泛應用的真核表達系統，具有較強的乙醇氧化酶啟動子，可有效地控制外源蛋白的表達，其翻譯后的糖基化修飾、折疊、加工和分泌的環境使生產的蛋白具有天然的高級結構及生物學活性，同時具有遺傳穩定性強，可以發酵培養到較高的細胞濃度等優點[5]。

本研究利用基因重組技術構建FSH的酵母表達載體并電擊轉化至畢赤酵母GS115中，通過甲醇誘導表達，來檢測畢赤酵母表達載體在FSH表達中的應用，為重組FSH激素的生產奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株

質粒pcDNAFSHα,β、大腸桿菌DH5α由本實驗室構建和保存；畢赤酵母表達載體pPICZαA、畢赤酵母菌株GS115購自Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑

限制酶EcoRI、Not I、Sac I, XhoI、XbaI，高保真聚合酶Pyrobest TM DNA Polymerase,DNA Ligation Kit Ver 2.0, MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0，DL2 000, DL15 000，Agarose Gel DNA Puri fication Kit Ver 2.0購自TaKaRa公司。DNA片段快速純化回收試劑盒YNB購自北京博大泰克生物基因技術有限公司，一抗為兔抗-FSHβ及二抗為羊抗兔IgG-HRP購自武漢博士德生物工程公司產品，FSH放免試劑盒購自北京科美東雅生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

LB培養基: 酵母抽提物5 g/L, 胰蛋白胨10 g/L, NaCl 10 g/L; 酵母培養基YPD、BMGY、BMMY具體配參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達手冊配制。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母表達載體pPICZαAFSHα,β的構建1.2.1.1 引物合成 根據畢赤酵母載體pPICZαA多克隆位點處酶切位點的特點以及FSHα,β基因序列上信號肽序列的位置，設計去掉信號肽的引物Fα、Fβ，其中陰影部分為酶切位點。

1.2.1.2 目的基因的擴增及重組到載體中 以pcDNA-FSHα,β為模板，用引物Fα、Fβ分別擴增出FSH的α和β亞基基因，Fα的擴增條件為94℃預變性4 min；94℃變性45 s, 56.4℃退火30 s，72℃延伸45 s, 30個循環；最后，72℃ 延伸2min；Fβ的擴增條件為94℃預變性4min；94℃變性45 s，60.6℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環；最后，72℃延伸2min。將獲得的目的基因及載體純化后用EcoRI、Not I雙酶切后再次純化，利用DNALigation Kit Ver 2.0 16℃連接30min后轉化感受態細胞DH5α，提取陽性菌落的重組質粒，進行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒進行測序分析。

1.2.2 重組質粒轉化入畢赤酵母中

將測序檢測正確的重組載體p PICZαAFSHα、β，分別使用Sac I酶切線性化處理后純化回收，使其濃度達到0.5～1μg/μL,然后電擊共轉化至感受態的畢赤酵母GS115中，電轉化參數為電壓1500 V，時間5ms，電轉化后將菌液涂到含有終濃度為100μg/mL的Zeocin的YPDS平板上，30℃培養2～3 d待菌落出現。

1.2.3 陽性酵母轉化子的誘導表達

挑選陽性單菌落接種25mL的BMGY于250mL的搖瓶中，30℃300 r/min振蕩培養到OD600達到2～6，離心收集菌體然后重懸于100mL的BMMY于1 L的搖瓶中，30℃300 r/min誘導表達，每24 h取1mL表達上清，同時加入100%的甲醇至終濃度為0.5%，取出的樣品最大轉速離心5min后，吸取上清－80℃保存待用。

1.2.4 表達產物的SDS-PAGA分析及W estern–blot檢測

將－80℃保存的表達上清放于冰上解凍，取10μL蛋白樣品加入4XSDS加樣緩沖液混合后100℃煮沸1min，然后進行SDS-PAGE分析，濃縮膠為5%、分離膠為15%，電泳結束后硝酸銀進行染色，并與標準蛋白分子量比較，將剩余樣品進行Western–blot檢測，具體操作見基因克隆理論與技術[6]。

1.2.5 放射免疫檢測上清中目的蛋白的表達量

將解凍的表達上清液，分別加入FSH抗體和I125－FSH，室溫放置16～18 h后加入分離劑，4000 r/min離心25min立即吸取上清液測定放射性計數(CPM)，根據標準濃度的CPM值繪制標準曲線，然后計算不同CPM值的表達上清中目的蛋白的表達量。

2 結果

2.1 FSHα,β亞基基因的PCR擴增

去掉信號肽序列后目的基因FSHα,β亞基大小分別為305 bp、350 bp，電泳顯示檢測的條帶與預期的大小相一致。

圖1 FSHα,β基因的PCR擴增

2.2 重組載體pPICZαAFSHα,β的酶切鑒定

畢赤酵母表達載體pPICZαA大小為3.6 kb，目的基因FSHα,β亞基大小分別為305 bp、350 bp，電泳檢測得到的條帶與預期的大小一致。測序結果顯示目的基因編碼區沒有發生突變，見圖2。

圖2 pPICZαA-FSHα, pPICZαA-FSHβ的雙酶切鑒定。M：DNA marker DL15 000

2.3 誘導表達產物的SDS-PAGE及Western–blot分析

將誘導表達的上清進行SDS-PAGE電泳后，用硝酸銀進行染色并與蛋白Marker比較后顯示在27 KD處有蛋白條帶的出現(見圖3)；電泳顯示誘導表達48 h未見明顯蛋白的表達，72 h開始有微弱的表達并隨著時間的延續表達量逐漸的增加。測定結果顯示168 h達到最大以后逐漸降低。Western–blot分析顯示27 KD處蛋白為FSHα,β表達的蛋白(見圖4)。

圖3 SDS-PAGE分析FSHαβ基因不同時間的表達

圖4 FSHα,β表達蛋白的 Western–blot 分析M: 蛋白Marker

2.4 目的蛋白的放射免疫檢測(RIA)

表達上清經放射免疫檢測后，并用SPSS11.0分析后結果見圖5。

圖5 FSHα,β基因表達蛋白的放射免疫檢測

結果顯示試驗組pPICZαA-FSHα,β獲得的表達量顯著高于對照組。

3 討論

巴斯德畢赤酵母表達系統是一個較好的被廣泛應用的真核表達系統，具有轉錄后加工修飾功能，遺傳操作簡單，成本低廉，適合于穩定表達有功能的外源蛋白，而且可大規模的發酵，是最理想的重組真核蛋白生產制備工具。巴斯德畢赤酵母表達載體分為自我復制型的游離載體和整合型載體，游離型載體能夠獨立于酵母染色體外自主復制，拷貝數通常可到30以上但不穩定，在傳代過程中易丟失影響重組菌的穩定性和表達量。整合型載體導入酵母中后與其染色體基因組DNA整合保證了蛋白生產菌株的穩定性。本研究所用的載體pPICZαA為最近開發的整合型表達載體，是以ZeocinTM抗性基因作為主要的選擇標記，可以對重組的轉化子進行直接和有效的篩選，可達到100%的ZeocinTM抗性轉化子都含有目的基因，沒有必要檢測插入的目的基因[7]。

FSH是糖蛋白激素其糖基化必須在信號肽的引導下進入內質網和高爾基體后才能完成。此外，蛋白的正確構象和翻譯后加工都是在分泌途中完成的。載體pPICZαA含有使用最為廣泛的α－交配因子的前導肽序列，Mital i samadda[8]等在對牛的FSHβ亞基進行畢赤酵母表達時分別使用了FSHβ信號肽和α－交配因子的前導肽序列，并進行了比較，發現當同源FSHβ信號肽替代為α－交配因子的前導肽后，FSHβ的表達量獲得了顯著的提高，表達量從230 ng/mL提高到4μg/mL。本研究設計了去除FSH信號肽的引物，利用載體上的α－交配因子的前導肽獲得了較高的表達，顯著地高于在細胞中的表達[9]。

糖類是促性腺激素分子的重要組成成分，約占促性腺激素分子量的20%～30%[10]，而FSH分子中大約含有16%的碳水化合物包括己糖、己糖胺、巖藻糖和唾液酸等。本研究表達的蛋白分子量為27 KD，FSHα,β預測的分子量為22.88 KD，加上糖基化的分子量與預期的結果相符合而沒有過度的糖基化，保證了目的蛋白的生物學活性和較小的抗原性。

本研究首次在畢赤酵母中成功的表達了促卵泡素基因，為利用畢赤酵母大量生產重組的促卵泡素奠定了基礎。但對于重組FSH的提取、純化和生物活性尚需要進一步的研究。

[1] 楊利國.動物繁殖學[M].北京：中國農業出版社，2010.

[2] Zhou JM.Prion diseases andthe“proteinonly”hypothesis[J].Prog Bichem Biophys,2004,31(2):95-105.

[3] Kobayashi M, Morita T, Ikeguchi K, et al.In vivo biological activity of recombinant goldfish gonadot ropins produced by baculovirus in si lk wormLarvae[J].Aquacul ture, 2006, 256: 433-442.

[4] Kumar TR,Schuf f KG,Nusser KD, et al.Gonadotroph-speci fic expression of the human fol l ic le stimulating hormone gene in transgenic mice[J].M and C Endocrinology,2006, 247:103-115.

[5] Anjal i Apte-Deshpnade,Goutam Mandal,Sudheerbabu Soorapaneni,et al.High-level expression of non-glycosylated and active staphylokinase from Pichia pastoris[J].Biotechnology Let ters,2009,31(6):811-817.

[6] 王廷華,董堅,齊建國.基因克隆理論與技術[M].北京：科學出版社,2009.

[7] Ying hua Li,Junje Bai,Qing Jian,et al.Expression of common carp growth hormone in the Yeast Pichia pastoris and growth stimulation of juveni letilapia(Oreochromis ni loticus)[J].Aquacul ture,2003(216):329-341.

[8] Samaddar M, Cat teral l JF, Dighe RR.Expression of biologically active ? subunit of bovine follicle-stimulating hormone in the methylotrophic yeast Pichia pastoris [J].Protein Expression &Puri fication, 1997, 10: 345-355.

[9] 孫雪萍，嚴正杰，楊歡利，等.山羊FSH類似物基因構建及其表達[J].畜牧獸醫學報，2006,37（12）：1250-1253.

[10] Muyan M,Boine I.The carboxyl-terminal region is a determinant for the intracellular behavior of the chorionic gonadot ropin subunit effects on the processing of the Asn-linkedol igosaccharides[J].MolEndocrinol, 1998, 12:766.