新奧霉素發酵液的理化性質和提取方法研究

寧停波 ，張 婷 ，周金燕 ，楊 杰 ，譚 紅

（1.中國科學院成都生物研究所應用與環境微生物研究中心，四川 成都 610041；2.中國科學院研究生院生命科學學院，北京 100049）

近年來，農用抗生素的篩選和應用已成為農業微生物領域的研究重點，利用放線菌產生的抗生素制備的新農藥已逐漸成為無公害農藥的主體[1]。因此，從放線菌的發酵液中尋找新的農用抗生素產物成為當前國內外的一個研究熱點[2]。

核苷類抗生素具有多樣的生物活性[3]，在醫療、農藥方面都有重要應用。由于來源于微生物的核苷類抗生素具有低毒和環境友好的特點，且在抗菌、殺蟲和抗病毒等方面具有較強的作用，所以相關研究越來越受到關注[4]。本實驗室從攀西地區土壤中篩選得到一株諾爾斯鏈霉菌（streptomyces noursei），該菌產生一種具有高效、廣譜抗菌作用的新型核苷類農用抗生素——新奧霉素（專利申請號，200910060121.4），經多輪誘變選育，已具有工業開發價值。本文就新奧霉素發酵液的理化性質及其提取方法進行了研究，為新奧霉素的發酵生產和農業應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

菌種：本實驗室從攀西地區土壤中篩選得到的諾爾斯鏈霉菌（streptomyces noursei）XiAo-3。生測指示菌：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），購自云南省微生物研究所保藏中心。生測培養基：牛肉膏蛋白胨培養基。發酵液：諾爾斯鏈霉菌（streptomyces noursei）XiAo-3經發酵罐發酵后提供。試劑和儀器：硅膠G薄層板、硅膠G200～300目（青島海洋化工），C18反相硅膠（YMC）；甲醇、氯仿、正丁醇、冰乙酸為分析純，去離子水；微濾裝置（成都連接流體分離科技有限公司），納濾膜（GE Water&Process Technologies），BUCHI-114 型旋轉蒸發儀，SBS-100型數控記滴自動分部收集器，高壓液相色譜系統為SHIMADZU（島津）液相色譜儀系統。

1.2 發酵液的預處理

發酵液中添加珍珠巖助濾劑，經過濾去除菌體和培養基殘渣。

1.3 發酵液理化性質

1.3.1 熱穩定性 各取10 mL發酵液于5支試管中，分別于 40、60、80、100℃下靜置 30、60、90 min，定時取出2 mL發酵液留作生測樣品，冷卻至室溫，管碟法測抑菌圈直徑，每個樣品重復3次。

1.3.2 pH穩定性 將發酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH 分別調節 pH 值至 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，靜置 24h 后，均調回發酵液初始 pH值，以未處理的發酵液為對照，管碟法測抑菌圈直徑，每個樣品重復3次。

1.3.3 紫外穩定性 將等量的發酵液置于波長為254 nm的紫外燈下分別照射15、30、45和60 min，以未處理的發酵液為對照，管碟法測抑菌圈直徑，每個樣品重復3次。

1.4 新奧霉素的提取方法

新奧霉素發酵液經助濾劑過濾后所得濾液，采用膜處理方法獲得新奧霉素濃縮液[5-6]；采用乙醇沉淀預處理發酵液，其上清液樣品經過兩次正相硅膠柱層析，再經減壓蒸發濃縮，可得白色或淡黃色粉末的新奧霉素。具體提取工藝路線，見圖1。

圖1 新奧霉素提取工藝

1.4.1 新奧霉素的膜提取方法 采用微濾（MF）—納濾（NF）組合分離法[7-8]制備新奧霉素濃縮液，具體工藝流程：將預處理的發酵液進行微濾，其透過液再經納濾，獲得新奧霉素濃縮液（圖2）。

1.4.2 乙醇沉淀 取4份發酵液，分別加入2、4、6、8 倍體積無水乙醇，靜置 1h，離心（6 000 r/min，15 min），分離上清液和沉淀，以未處理發酵液為對照，管碟法測抑菌圈直徑，每個樣品重復3次。

圖2 微濾-納濾裝置

1.4.3 正相硅膠柱層析 取適量乙醇沉淀上清濃縮液干法上樣，兩次正相硅膠柱層析的上樣量與硅膠裝柱量比例分別為1∶5、1∶67，采用不同梯度的氯仿/甲醇/水洗脫。

1.5 檢測方法

1.5.1 抑菌活性的測定 取含菌量為（6.4～10）×107個/mL蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）懸液，以體積比0.5%的比例添加到58℃左右的生測培養基中，混勻后迅速制成平板培養基，待凝固后將滅菌的牛津杯等距離均勻擺放，每個牛津杯加樣量200 μL（所有樣品均稀釋30倍），置30℃恒溫培養17 h后，測量抑菌圈直徑。

1.5.2 HPLC檢測 色譜柱:Agilent HC-C18柱（4.6×250 mm），λ：265 nm，流動相：甲醇/水（5/95，加0.05%冰乙酸)，流速：0.5 mL/min，柱溫：40℃。

2 結果與分析

2.1 發酵液的理化性質

2.1.1 熱穩定性 由表1可知，新奧霉素具有較好的熱穩定性。發酵液分別在40、60和80℃條件下，保溫90 min后，新奧霉素活性基本一致；但溫度達到100℃，保溫90 min后活性有所下降。因此，在分離提取過程中應盡量避免過高的溫度，減少對新奧霉素抑菌活性的影響。

表1 發酵液熱穩定性

2.1.2 pH值穩定性 新奧霉素發酵液初始pH值為3（CK），發酵液經酸、堿分別處理后，回調pH值至3，生測結果見圖3。結果表明用酸對發酵液處理后，其活性有微小的上升，而用堿處理后，抑菌活性隨著pH值的升高，有所下降。

圖3 發酵液pH值的穩定性

2.1.3 紫外穩定性 從圖4可知，新奧霉素發酵液對紫外照射不敏感。發酵液經過254 nm紫外光照射，抑菌活性無明顯變化，說明發酵液中的新奧霉素具有很好的紫外穩定性，無需避光保存。

圖4 發酵液紫外穩定性

2.2 新奧霉素的提取

2.2.1 膜分離提取新奧霉素 本實驗采用管式陶瓷膜對發酵液進行微濾，柱前后壓差1.3 kg，溫度25℃，流速8 L/h，透過液澄清且活性基本無變化。微濾透過液進入納濾裝置，柱前后壓差0.7 kg，溫度28℃，流量4 L/h，濃縮了5倍，活性回收率達90%以上。納濾可節省生產消耗成本，其截留濃縮液可以進一步進行納濾濃縮，制備濃度更高的新奧霉素母液。

圖5 不同體積倍數乙醇沉淀發酵液的影響

2.2.2 乙醇沉淀發酵液 采用不同體積倍數無水乙醇處理發酵液，去除一些雜蛋白質。結果表明，隨著乙醇體積倍數的增大，析出的固形物增多，上清液的抑菌活性減小（圖5），而沉淀的抑菌活性增加。當使用8倍體積乙醇沉淀發酵液時，沉淀的抑菌圈直徑已與上清液的抑菌圈直徑相近，說明此時新奧霉素已被大量沉淀。綜合考慮無水乙醇用量和新奧霉素的活性收率，選擇用4倍體積無水乙醇處理發酵液，活性收率在90%以上。

2.2.3 新奧霉素的柱層析分離 發酵液醇沉上清濃縮液經過第一次正相硅膠柱分離發現，當采用第一梯度洗脫劑（氯仿/甲醇/水體積比為 6.5∶3.5∶0.7）時，能洗脫大量色素和其它弱極性的物質；在第二梯度洗脫劑（氯仿/甲醇/水體積比 4.5∶5.5∶1.2）中，新奧霉素能夠被集中洗脫下來，在55℃減壓蒸發得到棕色膏狀樣品。此樣品經第二次硅膠柱分離，合并收集活性部分的洗脫液，濃縮干燥，得到白色或淡黃色新奧霉素粉末，經HPLC初步檢測新奧霉素峰面積大于97%，見圖6。

圖6 二次硅膠柱層析得到的新奧霉素HPLC圖譜

3 結論

新奧霉素是一種水溶性抗生素，其發酵液具有較好的紫外和熱穩定性，對酸堿不敏感。通過對新奧霉素發酵液理化性質的研究，可以有效地指導新奧霉素提取工藝條件，獲得較高的活性收率。新奧霉素發酵液添加珍珠巖助濾劑預處理，過濾得到的濾液，采用微濾-納濾組合分離法可以獲得體積濃縮5倍、活性收率90%以上的新奧霉素濃縮液；采用4倍體積無水乙醇沉淀和兩次正相硅膠柱層析，可以獲得含量大于97%的白色或淡黃色新奧霉素粉末。

利用膜工藝技術制備新奧霉素濃縮液的過程具有步驟簡單、耗能小等特點，且產品可進一步加工為新奧霉素母液進行工業化生產。由于本文提取新奧霉素粉末工藝的生產成本較高，所以還有待于進一步改進。

[1]代 鵬，等.一株拮抗放線菌菌株JFA-001的鑒定[J].植物保護學報,2008，35（1）：95-96.

[2]汪江峰，張玲玲，黃 劍.放線菌P3-2的抗菌活性篩選幾發酵液穩定性研究[J].現代農業科技，2010，6：16-19.

[3]Kiyoshi Isono.Nucleoside antibiotics:strutre,biological activity,and biosynthesis.The journal of antibiotics[J].1988,12:1711-1739.

[4]陳文青，鄧子新.核苷類抗生素代謝工程的研究現狀及展望[J].中國抗生素雜志，2009，34（3）：129-141.

[5]周德慶.微生物學實驗手冊 [M].上海：上海科學技術出版社，1986.

[6]Wang X L,Ying A L,Wang W N,Nanofiltration of L-phenylalanine and L-aspartic acid aqueous solution[J].J Membr Sci,2002,196（1）:59.

[7]Brites Alves A M,Morao A,Cardoso J P,et al.Isolation of antibiotics from industrial fermentation broths using membrane technol-ogy[J].Desalination,2002,148:181.

[8]Zhang W,He G,Gao P.et al.Development and characterization of composite nanofiltration membranes and their application in con-centration of antibiotics[J].Sep Purif Technol,2003,30:27.