紅曲霉菌株的誘變及其發酵條件研究

高國賦，魏寶陽，楊 瀚，孫繼民

（1.湖南省農業信息與工程研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；3.湖南省土壤肥料研究所，湖南 長沙 410125）

紅曲霉 （Monascus purpureusWent.）別名 紅曲、紅糟、紅大米，是散囊菌目中的一屬子囊菌曲霉科真菌，存在于樹木、土壤和堆積物等處。菌落初為白色，老熟后變成淡粉色、紫色或灰黑色，多形成紅色。紅曲色素是以紅曲米（經紅曲霉菌發酵的秈稻、粳稻、糯米等）為原料，利用現代的生物技術提取而成的天然著色劑。紅曲色素對pH、溫度、金屬離子氧化還原劑等較其他天然色素穩定，是一種優良的食品天然色素。在食品天然色素中，紅曲色素一直是國內外學者研究的焦點。有學者對其進行毒性試驗證明：紅曲色素安全無毒。紅曲色素應用于酒、糖果、熟肉制品、糕點等食品的著色，也可用于醫藥和化妝品的著色。目前，由于我國紅曲色素發酵生產設備、色素后期提取及精煉工藝比較落后，菌種產色的水平較低，色素生產成本較高，限制了紅曲色素在生產中的應用。通過菌種誘變選育提高生產菌株的發酵水平，降低生產成本，對我國食用色素產業的提升有著重要的意義。筆者采用紫外線和亞硝酸對紅曲霉進行誘變，獲得突變株，并對其發酵條件進行研究，以期為紅曲色素的生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料為紅曲霉（湖南農業大學生物科技學院生物工程系保存）；儀器有滅菌鍋（TOMY SS-325）、紫外可見分光光度計（VIS-9100）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅曲霉紫外誘變處理 紫外燈照射時間分別為：30、60、90、120、150、180、210 s；將盛有孢子懸液的平皿置于震蕩器上充分振蕩，紫外燈下照射30 s后，接種于3個平板，暗處培養，操作完成后再次紫外線處理30 s，按此操作直到完成7個梯度的照射，30℃暗培養，3 d后觀察，選取比出發菌株菌落大、顏色深的菌落。

1.2.2 紅曲霉化學誘變處理 制備亞硝酸濃度為0.01、0.02、0.04、0.08 mol/L 的誘變固體平板培養基。每平板涂布接種孢子懸液，30℃培養，2 d后觀察生長情況，選擇比出發菌株菌落大、顏色深的菌落，接種至不含亞硝酸的PDA斜面培養基上培養。

1.2.3 誘變菌株發酵能力測定 接種誘變株孢子懸液1 mL至發酵培養基，于30℃、130 r/min培養7～8 d，取菌液，4 000 r/min 離心 15 min，用 75%乙醇作為空白對照測定波長410 nm（黃色素）和510 nm（紅色素）處的OD值。

1.2.4 色價測定 胞外色素色價測定：在沒有標準品的情況下，參照國內外文獻，采用測定色素的色價來表示色素含量，色價（μ/mL）=測得的OD值×稀釋倍數，取2 mL發酵液過濾，以體積分數75%乙醇做空白對照，分別在410 nm、510 nm處測定胞外紅黃色素和紅色素。

菌體色素色價測定：稱取菌體0.05 g，用70%乙醇溶解，定容至100 mL，振搖30 min后靜置，取1.0 mL溶液，加70%乙醇溶液9 mL，用70%乙醇溶液作空白對照，在510 nm處測吸光度，按公式計算成品色價（μ/g）。

成品色價（μ/g）=OD510×1 000/樣品質量

1.2.5 發酵條件的研究 發酵條件的影響因素選取按正交表L16（45）（見表1）的設計進行液體培養。

表1 發酵條件研究的L16（45）正交表

（1）發酵條件與產色水平研究：菌液10 mL，4 000 r/min離心15 min，取上清液，以75%的乙醇作為空白對照，分別在510 nm測定紅色素和410 nm處測定黃色素，按公式計算總色價。

總色價=測得（OD410+OD510）×稀釋倍數。

（2）菌體量與發酵條件間關系的研究：菌液過濾，濾渣用蒸餾水反復沖洗至濾液無色透明，稱取菌體的濕重。同時每樣品挑取0.05 g菌體備用，余下菌體烘干后稱重。

（3）胞內色素與胞外色素含量分析：取16只試管，每支加入75%的乙醇10 mL，取步驟（2）中的0.05 g菌體，30℃萃取24 h后，4 000 r/min離心15 min，取上清液在410 nm和510 nm處測定OD值并記錄，按公式計算每g濕菌體色價。

每克濕菌體色價=A值×100×稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 優良菌株的篩選結果

經過紫外誘變和化學誘變后，分別篩選出了一株比出發菌株生長快、菌落大、顏色深的優良菌株，編為5-2和1-1-3，對應的照射劑量和誘變劑量為150 s和0.04 mol/L，在對比試驗中，5-2和1-1-3的發酵色價分別為7.09 U/mL和12.32 U/mL，并且1-1-3的生長速度大大優于5-2（見圖1）。因此最終篩選出1-1-3為最佳菌株，在同時接種的4只斜面試管中，1-1-3生長最為密集，菌落厚約2 mm，2.5 d后有大量菌絲長出，相比之下，5-2號菌落稀疏、2.5 d觀察時并未長出菌絲；因此確定1-1-3為最佳誘變菌株。

圖1 紫外誘變與化學誘變菌株對比

2.2 正交試驗結果

2.2.1 不同因素對產色量的影響 從表2和表3可以看出，各條件下色素產量有差異，色素產量最低的是2號和8號，沒有菌體生長，色素產量最高的是10號，其對應的發酵條件為：轉速160 r/min，pH為6，溫度為32℃，麥芽糖和牛肉膏。

從表2中可以看出，對胞外色素產量影響由大到小依次為：溫度>氮源>碳源>pH值>轉速，最適培養條件：轉速為 160 r/min，pH 值為 6，32℃，麥芽糖和牛肉膏；不同的溫度對胞外色素產量影響最大，最適宜溫度為32℃，不同氮源胞外色素產量差異較大，無機氮培養均在比較低的水平。

從表2中還可以看出，對胞內色素產量影響由大到小依次為：氮源>pH值>碳源>溫度>轉速，最適培養條件:轉速為130 r/min，pH值為5，26℃，麥芽糖和硝酸鈉。培養環境偏酸性，產色量與溫度成反比，與胞外色素情況相反，胞內色素對硝酸鈉的吸收較好。

2.2.2 不同因素對菌體生長的影響 各因素對干重與濕重的影響效果大致相同，按影響的重要性從大到小依次為：溫度>碳源>氮源>轉速>pH值。

2.2.3 紅色素與黃色素產量間的關系 從表3中可以看出，在細胞外部，黃色素產量普遍大于紅色素，單個常量最多是黃色素；總色素的產量以1號、7號、10號為多，所有條件中紅、黃色素產量差異較大的也是前述3瓶，可見產量越大，兩種色素產量差異越大，但不超過20%。在細胞內部，色素產量總體偏低，黃色素產量普遍大于紅色素，與胞外色素一樣，色素總產量越大，紅黃色素產色量的差異越大。紅色素產量的最佳發酵條件與菌絲生長除pH值因素以外基本相同，偏中性有利于紅色素的合成，最佳條件也與胞外色素的最佳條件一致，說明胞外色素在色素總產量中占主要部分。研究結果表明，黃色素的最佳發酵條件為：轉速160 r/min，pH值為5，溫度32℃，麥芽糖和牛肉膏，與紅色素基本相同。

表2 正交試驗結果

表3 各條件下胞內外色素含量與干濕重

3 討論

通過紫外誘變和以亞硝酸為誘變劑的化學誘變，得到了一株生長速度快、顏色深、穩定性好的突變株1-1-3號。紫外誘變和化學誘變這兩種傳統方法仍然是育種的有效手段，操作簡便、成本低、效果好，但是也存在缺點：工作量極大、定向誘變難度大，誘變劑量過大易引起負突變株比例增加，而且化學誘變試劑對環境和人體都有一定危害，如果能在代謝水平和基因水平上有所突破，那么傳統誘變方法有望退出人們的視線。

在發酵條件的研究中發現，紅曲霉所產的色素大部分分泌到胞外，產胞外色素最佳條件為：轉速160 r/min，pH 值為 6，32℃，麥芽糖和牛肉膏；產胞內色素最佳條件為：轉速 130 r/min，pH值為5，26℃，麥芽糖和硝酸鈉；菌體生長最佳條件為：轉速160 r/min，pH值為6，32℃，葡萄糖和牛肉膏。

紅色素和黃色素波長的最大吸收峰分別為510 nm和410 nm。從研究結果來看，胞內和胞外的兩種色素產量差異幅度較小，基本成正比，總色價較大的搖瓶中兩色素色價相差的絕對值比總色價小的要大，可能是因為紅色素和黃色素在代謝途徑上游有相同的前體物質，而在代謝途徑下游的酶活性差異較大，相同的前提物質合成量越大，最終產物—色素的產量差異也就越大。紅曲色素產量與氮源的種類密切相關，有機氮的利用優于無機氮；試驗還發現，酸性條件下有利于黃色素的合成，在生產發酵中如需增加紅色素的產量，可以通過調節發酵液的pH值偏中性來達到增產的目的；胞外色素產量的最佳調價為pH=6，有研究認為，偏酸時，H+可以與紅曲霉中的營養物質結合，從可交換的結合物或細胞表面置換出某些陽離子，使紅曲霉產生較多的色素；而當pH偏堿時，水合氫離子和OH-能降低營養物質的溶解度和細胞表面的電荷，從而降低產色。

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