p53 基因和FHIT 基因聯合檢測在肺癌早期診斷中的意義

王盛超，王紅巖，閻慧娟，馬 蕓

肺癌是威脅人類健康最主要的惡性腫瘤，絕大多數患者出現癥狀就診時已屬晚期，預后很差，改善肺癌預后的關鍵在于早期診斷。近幾年來隨著光學技術、計算機技術、分子生物學技術的迅猛發展，AFB 檢查及基因檢測應用于肺癌的早期診斷從理論上已成為可能。p53 基因和脆性組氨酸三聯體(fragile histidine triad，FHIT)基因是兩種常見的抑癌基因，且目前未發現兩者在調控細胞功能上無相關性。本研究對317 例利用自熒光支氣管鏡活檢的各類標本進行p53 基因和FHIT 基因檢測，擬為肺癌的早期診斷提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2009 年2 月～2010 年12 月在河南省人民醫院氣管鏡室進行自熒光支氣管鏡檢查的患者和體檢者的活檢標本，入組條件為所有標本常規組織病理學檢查結果明確，新鮮標本基因組DNA 及RNA 抽提可靠，檢查前均未行分子靶向治療、化療及放療。完全符合入組條件的患者共317例，男261 例，女56 例，年齡((53.7 ±9.5)歲。支氣管正常黏膜27 例、非典型增生74 例、原位癌23 例、浸潤癌161 例(其中鱗癌94 例、小細胞癌54 例、腺癌13 例)、良性病變32 例。

1.2 新鮮標本獲取及保存方法 采用日本OLYMPUS EVIS LUCERA BF－260 自熒光支氣管鏡(AFB)，按支氣管鏡檢查常規先后在白光成像模式(WLI)和自體熒光成像模式(AFI)檢查并照相記錄，對可疑病變區進行活檢及刷檢。取活檢組織10 ～15 mg 立即經－196℃液氮速凍15 min 后置0℃冰柜存放。其余組織標本及刷檢標本分別送組織病理學檢查及細胞學檢查。

1.3 p53 基因檢測 取約5 mg 組織標本，應用上海萊楓生物科技有限公司生產的動物組織基因組DNA小量提取試劑盒提取基因組DNA。根據Gene Bank上公布的p53 基因DNA 序列，應用primer 5.0 軟件設計p53 基因外顯子5、6、7、8 的引物，由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。引物序列見表1。PCR 反應體系(75 μL)中模板DNA 9 μL(0.1 μg/μL)，2 ×pfu PCR Master Mix 37.5 μL(上海來楓生物科技有限公司生產)，引物F 和R 各3 μL(5 μmol/L)，無菌三蒸水22.5 μL。具體反應條件見表1。反應完成后取5 μL PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴增產物。產物合格后送六合華大基因科技股份有限公司純化、測序。

表1 p53 基因PCR 擴增引物序列及PCR 反應條件

1.4 FHIT 基因檢測 采用Trizol(美國Invitrogene公司)抽提組織標本總RNA，分光光度計檢測后應用RT－PCR 試劑盒(杭州博日科技有限公司)進行RT－PCR 反應，以GAPDH 基因為內部參照。PCR 擴增引物序列及PCR 反應條件見表2。PCR 結束后進行2%瓊脂糖電泳。根據電泳結果選取部分PCR 產物測序(由六合華大基因科技股份有限公司純化、測 序)。

表2 FHIT 基因PCR 擴增引物序列及PCR 反應條件

1.5 統計學處理 應用SPSS 17.0 統計軟件，p53基因突變和FHIT 基因缺失的統計學處理采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者p53 基因突變率和FHIT 基因缺失率 正常黏膜組、不典型增生組、原位癌組、浸潤癌組、良性病變組p53 基因突變率分別為0、27.0%、52.2%、67. 7%、0，FHIT 基因缺失率分別為0、55.4%、65.2%、66.5%、9.4%、54.6%。詳見表3。

表3 各組患者p53 基因突變率和FHIT 基因缺失率

2.2 浸潤癌組患者各病理學分型p53 基因突變率和FHIT 基因缺失率 浸潤癌患者中，小細胞癌、鱗癌、腺癌組織中p53 基因突變率分別為90. 7%、57.4%、46.2%，FHIT 基因缺失率分別為88.9%、58.5%、38.5%。詳見表4。

表4 161 例浸潤癌患者病理學分型及p53 基因突變率和FHIT 基因缺失率

2.3 各組患者p53 基因和FHIT 基因聯合檢測結果 各組患者p53 基因突變和/或FHIT 基因缺失在正常黏膜、不典型增生、原位癌、浸潤癌、良性病變組織中 陽 性 率 分 別 為0、56. 8%、86. 9%、90. 7%、9.4%。具體詳見表5。

表5 各組患者p53 基因和FHIT 基因聯合檢測結果

3 討論

大量的研究結果表明，細胞的癌變是一個多因素、多基因參與調控、多階段、多步驟漸進演化的復雜過程。p53 基因是目前研究最多的，也是迄今發現在人類腫瘤中發生突變最廣泛的抑癌基因［1］。p53基因位于17p13.1，編碼－53kDa 肽鏈。p53 參與細胞周期的調節，誘導細胞凋亡，可通過不同機制避免損傷DNA 傳給子細胞，起著穩定基因組和抑制突變細胞產生的作用，從而達到抑制腫瘤發生的目的［2，3］。p53 正常功能的喪失最主要的方式是基因突變，其中95% ～98%的突變位于5、6、7、8 這4 個外顯子相對保守區域內，p53 突變可促進細胞惡性轉化，減少細胞凋亡，引起腫瘤發生。早在1992 年Takahashi 等［4］采用聚合酶鏈式反應－單鏈構象多態性(PCR－SSCP)方法發現小細胞肺癌中p53 基因突變率最高，可達80%，非小細胞肺癌中p53 基因突變率也可達60%。然而PCR－SSCP 分析技術操作復雜，受多因素影響，對部分基因變異的檢測，假陰性結果難以避免，更重要的是以往這些研究主要是在病理已經確診的肺癌手術切除標本上進行的，對臨床診斷實際意義不大。隨著分子生物學的飛速發展，特別是PCR－DNA 測序技術的不斷完善，準確檢測p53 基因突變已成為可能，本研究利用AFB 在臨床確診前對病變組織取材，應用PCR－DNA 測序技術對p53 基因進行分析，結果161 例肺癌患者中109例p53 基因發生突變，占67.7%，結合組織病理分型，p53 基因突變率在小細胞肺癌、鱗癌、腺癌中分別為90.7%、57.4%、46.2%，說明p53 基因突變在肺癌中是一個頻發事件，且在不同的病理類型組織中，p53 基因突變率差異有統計學意義(χ2=23.08，P ＜0.05)，這與以往文獻［5］報道結果不符，筆者翻閱大量文獻分析后認為與以往文獻報道結果不符的主要原因是因為取材方式不同，以往文獻報道收集的標本為術后標本，手術患者大部分為確診后的非小細胞肺癌患者，而小細胞肺癌患者很少手術。

過去由于技術水平的限制，制約了對肺癌相關癌前病變的研究，如在肺癌患者手術或尸檢時對癌前病變組織進行病理學和分子生物學研究，標本量極少。李紅鋼等應用顯微切割技術［6］對誘導的大鼠肺癌發生過程中不同階段的組織標本進行p53 基因分析和突變型p53 蛋白的表達分析，發現在正常支氣管上皮未發現有p53 突變和突變型p53 蛋白表達，在化生、不典型增生、原位癌、浸潤癌、轉移癌組織中p53 基因的突變率分別為3. 1%、28. 6%、30.3%、52.5%、52.9%。近幾年，隨著光學及計算機圖像分析處理技術的迅猛發展，AFB 已經研制成功并應用于臨床，其在支氣管不典型增生、原位癌等病變的早期定位診斷中顯示出明顯優勢。本研究借助于AFB 取材，在正常黏膜、非典型增生、原位癌、浸潤癌及良性病變中p53 基因突變率分別為0、27.0%、52.2%、67.7%、0%，即在正常黏膜及良性病變中未檢測出p53 基因突變，在非典型增生、原位癌、浸潤癌中p53 基因突變率隨著細胞惡性程度的增加而增高。正常黏膜組與非典型增生組兩組比較p53 基因突變率有顯著性差異(χ2= 9. 099，P ＜0.01);良性病變組與非典型增生組兩組比較p53 基因突變率有顯著性差異(χ2=10.660，P ＜0.01);非典型增生組與原位癌組兩組比較p53 基因突變率有差異(χ2=5.019，P ＜0.05);原位癌組與浸潤癌組兩組比較p53 基因突變率無差異(χ2= 2. 155，P ＞0.05)。提示p53 突變發生在肺癌形成的早期階段，尤其是原位癌階段，是促發腫瘤形成的重要因素，具有較好的敏感性和特異性，可應用于肺癌的篩查和早期診斷。

FHIT 基因是近幾年確定的一個抑癌基因，由10個外顯子組成，編碼含147 個氨基酸的16.8kDa 蛋白質即FHIT 蛋白。其具體作用機制不十分明確，初步研究以FHIT－ApnA 復合物為活性形式，參與微管形成，誘導細胞凋亡［7］。迄今為止的研究發現，腫瘤中FHIT 基因未見有點突變，主要異常的表現為缺失一個或數個外顯子。本實驗應用RT－PCR 及DNA 測序技術對新鮮標本進行FHIT 基因外顯子1-4 和5-9 檢測。在癌組織中總的FHIT 基因缺失率為66. 5%，在小細胞肺癌、鱗癌、腺癌中分別為:88.9%、58.5%、38.5%，三大病理類型之間差異顯著(χ2=14.96，P ＜0.001)，在小細胞癌中最高，在腺癌中最低。

FHIT 基因缺失率在正常黏膜、非典型增生、原位癌、浸潤癌及良性病變中分別為0、55. 4%、65.2%、66.5%、9.4%。非典型增生與良性病變組織中FHIT 基因缺失率顯著不同(χ2=19. 50，P ＜0.001)，提示FHIT 基因缺失在癌前病變及癌組織中除有高的敏感性外，還有很高的特異性。雖然在非典型增生、原位癌、浸潤癌組織中，隨著組織細胞惡性程度的加重FHIT 基因缺失率也逐步升高，但其差異無統計學意義(χ2=2.708，P ＞0.05)。而正常黏膜組織內未檢測到FHIT 基因缺失，提示FHIT 基因在細胞惡性轉化中起關鍵作用，于原位癌形成前常常已發生缺失，這與p53 基因突變率在非典型增生與原位癌組織中有明顯差異不同，FHIT 基因缺失可能比p53 突變發生更早，除有助于肺癌的早期診斷外，還能用于對高危人群進行篩查及個體危險度的較準確評估，以指導高危患者預防腫瘤。

兩基因聯合檢測也表現出一定的優勢。由表3可知，p53 基因和FHIT 基因聯合檢測兩基因同時陽性對肺癌(原位癌和浸潤癌)的敏感性為36. 4%(67/184)，特異性為77.9%(67/86);同時陽性對肺癌及癌前病變的敏感性為33.3%(86/258)，特異性為100%(86/86)。p53 基因和/或FHIT 基因檢測陽性對肺癌及癌前病變的敏感性為80. 6% (208/258)，特異性為98.6%(208/211)。p53 基因、FHIT基因及兩基因聯合檢測對肺癌診斷的敏感性分別為:65. 8% (121/184)、66. 3% (122/184)、90. 2%(166/184)。p53 基因與FHIT 基因分別檢測兩者差異無統計學意義(P ＞0.05)。兩基因聯合檢測較單基因檢測敏感性明顯提高，兩者差異明顯(P ＜0.001)。

綜上所述，p53 基因突變和FHIT 基因缺失在肺癌中不僅是一個頻發事件，而且可能是肺癌發生過程中的早期事件，是促發腫瘤形成的重要因素，可作為早期診斷的標準，兩者聯合檢查可提高肺癌診斷的敏感性。同時能對高危人群及個體危險度進行較準確的估計，有助于肺癌的早期診斷。隨著對兩基因的進一步研究，更敏感、簡單、經濟、實用的檢測方法將會出現，兩基因最終可能成為理想的檢查早期肺癌的分子標志物。

［1］Vousden KH，Prives C. Blinded by the light:the growing complexity of p53［J］.Cell，2009，137(3):413－431.

［2］Meek DW. Tumor suppression by p53:a role for the DNA damage response［J］.Nat Rev Cancer.2009，9(10):714－723.

［3］Green DR，Kroemer G. Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53［J］.Nature 2009，458:1127－1130.

［4］Takahashi T，Carbone D. Wild-type but mutant p53 suppresses the growth of human lung cancer cells bearing multlple genetic lessions［J］.Cancer Res，1992，52:2340.

［5］庹新蘭，白明.脆性組氨酸三聯體基因及p53 基因在肺癌組織中的表達及意義［J］.腫瘤防治研究，2007，34(2):109.

［6］李紅鋼，劉銘球，刁路明，等.用顯微切割技術定點檢測誘發大鼠肺癌發生發展各階段p53、K-ras 基因突變與表達［J］.中華病理學雜志，2002，31(4):331－336.

［7］Deng Wu-guo，Nishizaki M，Fang Bing-liang，et al. Induction of apoptosis by tumor suppressor FHIT via death receptor signaling pathway in human lung cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，355(4):993－999.