腦出血小鼠行為學改變和低氧誘導因子-1 α的表達△

西安市中心醫院 (西安 710004)張 琳 徐 曦 譚 敬 肖新莉 馬 勇

低氧誘導因子 -1 α(Hypoxia inducible factor-lα,HIF- lα)是低氧應答過程中起重要作用的轉錄因子,具有促進無氧代謝,血管形成,血管擴張及紅細胞攜氧的作用。 HIF- lα對腦缺血缺氧損傷具有保護作用,其作用機制為改善腦缺血后的能量代謝障礙,促進血液動力學恢復,抑制興奮性氨基酸的神經毒性,減少細胞凋亡等[1,2]。但是一些研究也發現,HIF-lα過度表達使細胞內 P53水平增加,促進 Caspases 3的激活表達,導致神經毒性從而促進細胞凋亡[3]。本研究旨在觀察腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)期間腦組織中HIF-1 α表達的時程和分布特征,以探討腦出血后HIF-1 α表達的意義,為缺血性腦血管病的治療提供新的途徑。

材料與方法

1 材 料

1.1 動物與分組:選用西安交通大學醫學院動物實驗中心提供的健康成年雄性昆明小鼠 40只,體重在25～ 30g,由動物中心配制的普通小鼠飼料喂養,飲用自來水,分成假手術組組和腦出血組。腦出血組于術后7d、14d處死,冰凍切片,用于低氧誘導因子表達免疫組化測定,各組 5只。

1.2 藥物與試劑:兔抗小鼠 HIF-1 α抗體(美國Bioworld,Millipore公司提供),ABC試劑盒(美國Vector公司提供),羊抗兔抗體、DAB顯色試劑盒(由北京中山公司提供),Ⅳ型膠原酶(美國 Sigma公司提供)。

1.3 儀器:腦立體定位儀為美國 Stoelting公司生產,低溫恒冷冰凍切片機(HM 505E Leica)系德國萊卡公司生產,熒光顯微鏡(Nikon E800)為日本尼康公司生產,微量進樣器為上海玻璃儀器廠生產。

2 方 法

2.1 實驗性腦出血模型的制作及處理:動物經10% 水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,俯臥位固定于腦立體定位儀上,前、后囟在同一水平面。在兩耳和兩眼之間皮膚正中線上縱形切開,暴露前囟。在前囟前 0.5mm,旁開 2.5mm處用牙科鉆垂直鉆透顱骨,5 μL微量進樣器固定于立體定位儀上,由骨孔緩慢進入紋狀體,進針深度距顱骨表面 6mm。將Ⅳ型膠原酶 0.075U注入,注射時間 10min,留針 10min,緩慢退出注射器,骨蠟封閉骨孔,縫合頭皮。術后觀察動物至清醒后,歸籠飼養。假手術組動物在同位置注入等量生理鹽水。

2.2 行為學觀察:采用 Berderson評分法[4]。輕抓尾巴,提起大鼠高于桌面 10 cm,正常大鼠前爪伸直。0分:沒有神經功能缺損;1分:左側腕關節、肘關節屈曲,肩內收屈曲;2分:上述體征+向左側阻力下降;3分:活動時向左側轉圈(追尾)。

2.3 組織切片制備和組織學觀察:所有小鼠麻醉后經左心室灌注冰肝素生理鹽水 200 ml和 4%多聚甲醛 400 ml(0.1 M PB,pH 7.4),斷頭取腦,組織塊后固定于 4%多聚甲醛 4℃過夜,入 30%蔗糖(0.1 M PB,pH 7.4)2～3d至組織塊沉底,液氮驟冷,組織保存于-80℃。切片時在前囟前 0.4 mm至前囟后1.4 mm范圍,用冰凍切片機行冠狀切片,片厚40 μ m,切片裱于 APES處理的載玻片上,-30℃保存待用。 HE染色用于組織學觀察。

2.4 HIF-1 α免疫組織化學染色:冰凍切片 0.01 M PBS漂洗,滴加正常兔血清封閉非特異性抗原,室溫濕盒孵育 1h,去除血清,滴加一抗,4℃濕盒過夜,0.01 M PBS漂洗,滴加生物素化二抗,濕盒室溫孵育2h,0.01 M PBS漂洗,ABC室溫孵育 1h,0.01 M PBS漂洗,DAB顯色 5～10min,蒸餾水漂洗,梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、觀察。

2.5 細胞計數:細胞計數在 Nikon 800顯微鏡高倍視野 400倍下進行,圖像顯示于計算機顯示屏上。用 IPP(Image pro plus 6.0)醫學圖像分析軟件計數每個視野的 HIF-1 α陽性細胞數,取均數為各時點HIF-1 α陽性細胞數。以細胞密度(陽性細胞數 /mm2)表示,5張切片的均值代表該小鼠的計數結果。

2.6 統計學處理:用 SPSS10.0軟件包進行分析,計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用方差分析(One-way ANOVA)。

結 果

1 ICH后組織學改變:膠原酶注射后 1d可形成穩定的血腫,血腫位于紋狀體。在 HE染色切片上,ICH后第 7天,HE染色光鏡下可見出血灶與正常腦組織間有一過度帶即血腫周圍區,血腫周圍水腫,組織疏松,星形細胞腫脹,神經細胞變性、壞死,出血灶周邊毛細血管增生伴炎細胞浸潤,同側側腦室受壓、變小(圖 1A);第 14天時出血灶明顯縮小,血腫周圍大量炎性細胞 (圖 1B)。

圖1 腦出血組織的 HE染色 (A:ICH后 7d;B:ICH后14d。標尺在 B:長度=2mm)

2 ICH小鼠行為學改變:Berderson行為學評分顯示 ICH后第 7天小鼠出現嚴重的神經功能障礙,神經功能評分顯著低于正常對照組(P＜0.05),見表 1。

表1 小鼠 ICH后 Berderson行為學評分 (±s,分)

表1 小鼠 ICH后 Berderson行為學評分 (±s,分)

與假手術組比較,* P＜0.05

組 別 n 第 7天 第 14天假手術組 5 0.2±0.4472 0.3333±0.5164腦出血組 5 2.2± 0.8367* 1.8333±0.7528*

圖2 大腦皮質 HIF-1α蛋白表達(A:假手術組 HIF-1α表達;B:ICH后 7d;C:ICH后 14d。 標尺在 C:長度=200 μm)

3 ICH小鼠大腦皮質 HIF-1 α蛋白表達動態變化:假手術組腦組織皮層有極少量表達 HIF-1 α的陽性細胞。 ICH組各時間點 HIF-1 α表達高于假手術組(圖 2),差異具有統計學意義(P＜0.05)。

表1 小鼠 ICH后出血側大腦皮質 HIF-1 α陽性細胞計數(個 /mm2)

4 ICH小鼠出血灶周圍半暗帶的 HIF-1 α蛋白表達動態變化:假手術組紋狀體有極少量表達 HIF-1 α的陽性細胞。 ICH組各時間點 HIF-1 α表達高于假手術組(圖 3),差異具有統計學意義(P＜0.05)。

圖3 腦出血灶周圍半暗帶 (紋狀體)的 HIF-lα蛋白表達

表3 小鼠 ICH后出血灶周半暗帶 HIF-lα陽性細胞計數(個 /mm2)

討 論

小鼠 ICH后存在嚴重的行為學障礙,這種障礙在ICH后第 2天最為明顯,在 1～ 4周逐漸恢復。本實驗結果顯示 ICH后第 7天小鼠依然表現有嚴重的神經功能障礙。

HIF-1是一種缺氧誘導的主要轉錄因子,含一個α亞單位和一個β亞單位,其中 HIF-1 α是可調控的功能單位,受氧濃度變化的調節,缺氧后其轉錄活性增加。目前認為 HIF-1 α可以作為組織缺氧的標志[5]。既往研究發現 HIF-1 α上調后具有神經保護作用[6]。Yuan LB等研究發現 HIF-1 α在缺氧缺血性腦損傷的保護中起著重要作用[7,8]。無論是在全腦缺血、局灶性腦缺血時,腦組織中都發現有 HIF-1 α的激活。 Wu W等[9]將基因重組的腺病毒 HIF-1 α轉染的神經干細胞移植到腦缺血 24h的大鼠側腦室,腺病毒 HIF-1 α轉染的神經干細胞移植組較其他組神經功能改善更加明顯,并且發現改組的缺血損傷區域第Ⅷ因子陽性細胞數目增加,表明 HIF-1 α的表達可促進血管新生。因此,運用 HIF-1 α基因治療是缺血性腦損傷治療中的新的途徑。本實驗的結果表明在缺氧情況下,HIF-1 α在損傷缺氧區表達明顯增加,用于對缺氧的應激,與以往的研究結果一致。

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[2]Harten SK, AshcroftM,MaxwellPH. Prolyl hydroxylase domain inhibitors:a route to HIF activation and neuroprotection[J].Antioxid Redox Signal,2010,12(4):459-80.

[3]Rohwer N,Dame C,Haugstetter A,et al.Hypoxiainducible factor 1alpha determines gastric cancer chemosensitivity via modulation of P53 and NF-kappaB[J].PLO S One,2010,5(8):e12038.

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[8]Shi Q,Zhang P,Zhang J,et al.Adenovirus-mediated brain-derived neurotrophic factor expression regulated by hypoxia response element protects brain from injury of transient middle cerebral artery occlusion in mice[J].Neurosci Lett,2009,465(3):220-5.

[9]Wu W,Chen X,Hu C,et al.Transplantation of neural stem cells expressing hypoxia-inducible factor-1alpha(HIF-1alpha)improves behavioral recovery in a rat stroke model[J].J Clin Neurosci,2010,17(1):92-5.