二氯醋酸二異丙胺對重癥胰腺炎肝臟損傷的保護機制研究

瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 (瀘州 646000)劉 宏 鄧明明 王何 彩

急性重癥胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)是一種多系統(tǒng)疾病。 SAP不但累及胰腺,而且累及肝、肺及腎臟等遠處器官[1]。肝臟是胰腺血液回流的第一站,病變胰腺釋放大量炎癥介質(zhì)及蛋白酶在肝臟損害中也發(fā)揮一定作用。在病變加重時可發(fā)展成為肝衰竭,一旦肝功能衰竭發(fā)生就可導(dǎo)致多器官功能障礙(MODS)的發(fā)生,使患者的病死率明顯的增加。大量的證據(jù)表明肝細胞過度凋亡可能是肝細胞功能衰竭的重要原因。細胞凋亡調(diào)控基因中最受關(guān)注的就是 Bcl-2,細胞色素 C及 fas家族。DADA是臨床常用的保肝藥,在胰腺炎肝臟損傷的治療中有確切的臨床療效。本研究利用 SAP肝臟損害大鼠模型,探討肝細胞凋亡和細胞色素 C、Bcl-2基因表達在 SAP肝臟損害發(fā)病機制中的作用以及應(yīng)用 DADA治療后的影響。

材料和方法

1 實驗動物和分組 SD雄性大鼠 78只,體重250g～ 300g,由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。隨機分成四組:正常組 6只,假手術(shù)組 24只,SAP組 24只,DADA治療組 24只。 每組再分為 12h、24h、48h、72h四個時間點,每個時間點分配 6只大鼠。

2 動物模型的制備 大鼠采用 3%戊巴比妥鈉1ml/kg腹腔注射麻醉,平臥固定,取上腹橫切口,將胃提出腹外翻轉(zhuǎn),使胰腺組織充分暴露,小動脈夾夾閉胰管近肝門部。SAP組及 DADA組用 4號針頭于十二指腸乳頭開口處刺破腸管進入胰管,依次向胰管開口方向推進,緩慢推注 5%牛磺膽酸鈉 1ml/kg,使整個胰腺均勻隆起,去除動脈夾,退出針頭關(guān)腹。DADA組于模型制備成功后,經(jīng)尾靜脈注射 DADA 0.375ml/(kg?12h);SAP組尾靜脈注射等劑量生理鹽水;假手術(shù)組僅翻動胰腺組織周圍的腸管隨即關(guān)腹。造模后 12h、24h、48h、72h等各時間點處死大鼠,心臟穿刺抽血,快速切取肝臟組織,測定各項指標。

3 檢測項目及方法

3.1 全自動生化分析儀測定 AST、ALT。

3.2 肝臟組織病理學(xué)觀察各組織光鏡標本以甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋、HE染色,光鏡觀察。

3.3 肝臟細胞凋亡的測定:采用 DNA末端原位標記法(TUNEL法,試劑盒購自武漢博士德公司)。切片常規(guī)脫蠟入水,經(jīng) 2%H2O2處理、蛋白酶 K消化后,加人 TDT和 Dig.dUTP 4℃過夜,封閉后加生物素化抗地高辛抗體 ,洗滌,加 SABC,DAB顯色,光鏡下計算肝臟細胞凋亡指數(shù)(Apoptotic Index,AI)。 AI計算方法:細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞,即凋亡細胞,數(shù) 4個高倍視野,分別計算凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù),Al=凋亡細胞數(shù) /總細胞數(shù)×100。

3.4 肝臟凋亡相關(guān)基因 Bcl-2、fas、細胞色素 C的測定采用 SABC免疫組化染色法(免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司)。染色模式:胞膜或胞漿。①定性分析根據(jù)染色強度分為:陽性(棕黃色);弱陽性(淺黃色);陰性(不著色)。②定量分析各組切片均采用圖像分析系統(tǒng)對免疫組化染色陽性反應(yīng)產(chǎn)物進行定量分析。具體操作為:取切片在光學(xué)顯微鏡下以相同倍數(shù)(40×10)于肝組織隨機選取 10個視野,利用圖像分析系統(tǒng)分析陽性面積和陽性區(qū)域平均灰度值,并將陽性面積和平均灰度值按文獻方法[2]換算成陽性單位(Positive unit,PU),以 PU值大小代表陽性產(chǎn)物表達的多少。

結(jié) 果

1 肝臟組織病理學(xué)改變

1.1 肉眼所見假手術(shù)組未見異常;SAP組 12h時腹腔見少量滲液,大網(wǎng)膜水腫,肝臟體積略增大,包膜正常;24h時腹腔內(nèi)血性腹水增多,大網(wǎng)膜明顯水腫并出現(xiàn)皂化,肝臟體積增大,包膜略緊張,與胰腺有少許的粘連;48h時腹腔內(nèi)見大量血性腹水,大網(wǎng)膜、腸系膜大片皂化,肝臟體積增大,包膜緊張,顏色稍淡,與胰腺粘連明顯,可見粘連部位肝臟組織壞死;72h時腹腔內(nèi)見大量惡臭血性腹水,大網(wǎng)膜、腸系膜大片皂化,肝臟體積明顯增大,包膜緊張,顏色明顯變淡,與胰腺粘連較重,與胰腺粘連部位肝臟組織明顯壞死;DADA組各時間點肝臟大體變化均較 SAP組明顯減輕。

1.2 光鏡下所見假手術(shù)組未見異常;SAP組 12h時肝細胞腫脹,細胞間隔增寬,少量炎細胞浸潤;24h時肝臟組織脂肪變明顯,肝細胞腫脹加重,細胞間隔增寬,間質(zhì)內(nèi)炎性細胞浸潤,紅細胞淤積;48h時可見局灶性或不規(guī)則片狀肝細胞壞死,肝竇及匯管區(qū)周圍大量炎性細胞浸潤及紅細胞淤積;72h時可見不規(guī)則片狀或大片肝細胞壞死,肝竇及匯管區(qū)周圍大量炎性細胞浸潤及紅細胞淤積;DADA組各時間點鏡下所見均較 SAP組明顯減輕。

2 AST、ALT的改變 SAP時 AST、ALT明顯升高,且隨著病程延長而逐漸增高;應(yīng)用 DADA治療后,AST、ALT明顯下降,但仍有隨著病程延長而逐漸增高的趨勢,見表 1,2。

表1 各組大鼠血清 ALT變化(±s)

表1 各組大鼠血清 ALT變化(±s)

與 N組及假手術(shù)組比較,* P＜0.05;與 SAP組比較,▲ P＜0.05

ALT(U/L)組 別12h 24h 48h 72h N組 41.66± 4.59 41.66± 4.59 41.66± 4.59 41.66± 4.59假手術(shù)組 56.60± 6.02 55.63± 7.39 57.2± 9.07 54.53± 7.29 SAP組 206.35± 12.71* 248.93± 36.89* 302.33± 28.30* 317.57± 25.71*DADA組 126.30±40.31▲ 95.65±18.67▲ 87.53± 11.14▲ 60.40±22.24▲

表2 各組血清 AST變化(x-±s)

3 肝臟細胞凋亡情況 正常組及假手術(shù)組有極少量凋亡細胞,SAP組凋亡細胞明顯增多,凋亡指數(shù)升高,并隨著病程延長而逐漸增高,DADA組凋亡指數(shù)較 SAP組明顯下降。各組肝臟組織細胞凋亡指數(shù),見表 3。

表3 各組大鼠肝臟細胞凋亡指數(shù)(±s)

表3 各組大鼠肝臟細胞凋亡指數(shù)(±s)

與 N組及假手術(shù)組比較,* P＜0.05;與 SAP組比較,▲ P＜0.05

TUR組 別12h 24h 48h 72h N組 0.0046± 0.0007 0.0046± 0.0007 0.0046± 0.0007 0.0046± 0.0007假手術(shù)組 0.0052± 0.0010 0.0053± 0.0006 0.0053± 0.0005 0.0053± 0.0005 SAP組 0.0276± 0.0043* 0.0344± 0.0040* 0.0378± 0.0044* 0.0456± 0.0044*DADA組 0.0156± 0.0030▲ 0.0177±0.0022▲ 0.0174± 0.0021▲ 0.0123± 0.0032▲

4 肝臟細胞細胞色素 C、Bcl-2、Fas基因表達的變化 正常組及假手術(shù)組細胞色素 C、Bcl-2、Fas基因的表達均較弱;SAP組細胞色素 C、FAS基因有表達,尚隨著病程延長而逐漸增高,Bcl-2表達值隨著病程延長而逐漸下降;DADA組與 SAP組比較,細胞色素 C、Fas基因表達明顯下調(diào),而 Bcl-2基因表達明顯上調(diào)。各組肝臟組織細胞色素 C、Bcl-2、fas表達,見表 4～ 6。

表4 各組大鼠肝臟細胞細胞色素 C表達(±s)

表4 各組大鼠肝臟細胞細胞色素 C表達(±s)

與 N組及假手術(shù)組比較,* P＜0.05;與 SAP組比較,▲ P＜0.05

細胞色素 C組 別12h 24h 48h 72h N組 0.0261± 0.0020 0.0261± 0.0020 0.0261± 0.0020 0.0261± 0.0020假手術(shù)組 0.0264± 0.0046 0.0228± 0.0029 0.0315± 0.0045 0.0289± 0.0021 SAP組 0.1057± 0.0136* 0.1608± 0.0095* 0.1878± 0.0148* 0.2161± 0.0181 DADA組 0.0735± 0.0053▲ 0.0630± 0.0059▲ 0.0778± 0.0065▲ 0.0587± 0.0083▲

表5 各組大鼠肝臟細胞 Bal-2表達(±s)

表5 各組大鼠肝臟細胞 Bal-2表達(±s)

與 N組及假手術(shù)組比較,* P＜0.05;與 SAP組比較,▲ P＜0.05

Bcl-2組 別12h 24h 48h 72h N組 0.0105± 0.0010 0.0105± 0.0010 0.0105± 0.0010 0.0105± 0.0010假手術(shù)組 0.0137± 0.0018 0.0119± 0.0026 0.0108± 0.0015 0.0095± 0.0016 SAP組 0.2066± 0.0128* 0.1465± 0.0216* 0.1377± 0.0423* 0.0798± 0.0329*DADA組 0.0932± 0.0588▲ 0.2999± 00.0356▲ 0.5734± 0.0866▲ 0.6291±0.0682▲

表6 各組大鼠肝臟細胞 Fas表達(x-±s)

討 論

研究發(fā)現(xiàn)胰腺炎肝細胞損害的病理表現(xiàn)為光鏡下可見肝細胞變性、散在的液化性壞死灶,庫普弗細胞腫脹。電鏡下可見糖原顆粒減少,但脂質(zhì)小滴大小和數(shù)目增加;線粒體腫脹,其基質(zhì)和嵴變性;自噬體和溶酶體增多;肝竇內(nèi)皮損害伴吞噬細胞活性增加。 Isogai等[3]對 26例膽源性急性胰腺炎患者進行肝穿刺活檢,大部分均有不同程度的肝臟損害。光鏡下主要的組織病理學(xué)特征為散在的肝細胞壞死和急性膽管炎;電鏡下可見肝細胞排列無序、膽小管擴張及膽汁潴留,部分區(qū)域的 Diss間隙尚可見肝細胞內(nèi)容物。 Takeyama等[4]在體內(nèi)以 20%脫氧膽酸鈉(DCA)誘發(fā)大鼠 AP模型及健康大鼠腹腔注射胰腺炎相關(guān)性腹水(Pancreatitis associated ascitic fluid,PAAF)或在體外將不同濃度的 PAAF與原代肝細胞一起孵育,采用原位末端標記、瓊脂糖凝膠電泳、細胞周期分析等技術(shù)檢測,均發(fā)現(xiàn)肝細胞凋亡較對照組顯著增多。

細胞的凋亡是受基因調(diào)控的,細胞凋亡的調(diào)控基因中最受關(guān)注的是 Fas/FasL基因和 Bax/Bcl-2。研究發(fā)現(xiàn) AP時 Kupffer細胞衍生的 Fas配體(FasL1、p38-MAPK)、Caspase-3表達增加并且誘導(dǎo)了肝細胞的凋亡損傷[5,6]。推測 Fas/FasL在 AP肝細胞的凋亡中起關(guān)鍵作用。并認為 Kupffer細胞衍生的 Fas/FasL誘導(dǎo)的肝細胞凋亡和 NF-kappa B途徑誘導(dǎo)的 Kupffer細胞凋亡之間的平衡失調(diào)程度決定了 AP時肝臟損傷的程度。

Bcl-2和 Bax都是 Bcl-2家族成員,Bcl-2的生理功能主要是抑制細胞凋亡,延長細胞壽命。 Bcl-2與Bax可形成同二聚體或異二聚體來改變線粒體的通透性,從而決定細胞的生存與死亡。當(dāng) Bcl-2相對量高于Bax時,Bcl-2同二聚體增多并促進形成 Bcl-2-Bax異二聚體,而 Bcl-2同二聚體和 Bcl-2-Bax異二聚體都可抑制細胞凋亡;相反當(dāng) Bax的量相對高于 Bc1-2時,則Bax同二聚體增多,從而促進細胞凋亡[7]。因而 Bcl-2/Bax兩蛋白比例時決定細胞凋亡或存活的關(guān)鍵因素[8],而應(yīng)用 DDFA(包括 D:地塞米松,D:低分子右旋糖酐,F:5-氟脲嘧啶,A:抑肽酶)治療后,Bax基因表達明顯下調(diào),而 Bel-2基因表達明顯上調(diào),Bcl-2/Bax比值上升。因此認為,DDFA對肝功能的保護作用可能部分是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因 Bax和 Bcl-2從而影響細胞凋亡實現(xiàn)的[9]。

線粒體在肝細胞凋亡中發(fā)揮重要作用,細胞受到凋亡信號刺激后,線粒體發(fā)生腫脹,位于線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔道(Mitochondriumpermeability transition pore,MPTP)開放,使線粒體外膜電位降低、破裂,線粒體內(nèi)細胞色素 C(Cytochrome C,Cyt C)、凋亡誘導(dǎo)因子 (Apoptosis inducing factor,AIF)、Ca2+以及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)等釋放到胞質(zhì)中,分別通過破壞核內(nèi)染色質(zhì)或激活 Caspase或作用于其它 Ca2+依賴性蛋白,而引起細胞凋亡。

線粒體通過釋放出凋亡誘導(dǎo)因子和(或)細胞色素C誘導(dǎo)凋亡。如線粒體內(nèi)膜發(fā)生損傷,則可導(dǎo)致線粒體功能的改變和肝細胞壞死。另外,一系列的單細胞的研究發(fā)現(xiàn),在缺氧或高氧的情況下,激活線粒體的滲透轉(zhuǎn)換能力能促進細胞死亡[10]。

DADA是臨床常用的保肝藥,臨床療效確切[11]。DADA的代謝產(chǎn)物有二異丙胺和甘氨酸,其中甘氨酸能通過甘氨酸裂解酶作用生成甲基四氫葉酸(N2H10-CH4-FH4),能為肝細胞代謝提供能量;通過激活丙酮酸脫氫酶(PDH)復(fù)合物以增加 PDH活性,增加葡萄糖氧化、促進三羧酸循環(huán)而改善肝細胞的能量代謝。同時另一代謝產(chǎn)物二異丙胺在三磷酸腺苷(AT P)活化作用下生成甲硫氨酸,甲硫氨酸與甲基四氫葉酸均可提供甲基,促進膽堿合成。膽堿與肝脂肪作用生成卵磷脂,生成的卵磷脂能促進膜磷脂的序貫甲基化,增強肝細胞膜的流動性,提高作為膽汁分泌和流動主要動力的鈉-鉀-AT P酶的活性,從而促進肝細胞再生。因此,能使受損肝細胞得到修復(fù),同時提高組織細胞呼吸功能及氧利用率,提高脂肪酸的代謝活性,加速脂肪酸的氧化,并調(diào)節(jié)肝臟能量平衡,為肝臟功能恢復(fù)創(chuàng)造條件[12]。

有報道[13],D-氨基半乳糖氨所致中毒性肝損傷模型,其肝組織病理學(xué)和生化改變與人類病毒性肝炎相似。我們的實驗發(fā)現(xiàn),隨著病程的進展大鼠肝細胞內(nèi)的fas基因及細胞色素 C的表達明顯的增加,同時細胞內(nèi)的 Bcl-2表達是降低的這與大鼠的肝細胞凋亡增加肝功能的進一步惡化時一致的,肝細胞的凋亡與肝功能有著明顯的相關(guān)性且隨著肝細胞凋亡數(shù)目的增加肝功能進一步的惡化。說明胰腺炎的肝臟損害存在著肝細胞及線粒體的能量代謝障礙,而肝臟的損害至少部分是通過凋亡產(chǎn)生的。而采用 DADA治療以后大鼠的肝功能得到明顯的改善 AST、ALT明顯的下調(diào),同時細胞凋亡基因 fas、細胞色素 C表達明顯的降低而凋亡抑制因子 Bcl-2表達明顯的上調(diào),病理結(jié)果顯示肝臟損害明顯的減輕,肝細胞凋亡指數(shù)也明顯的降低;說明DADA能夠改善肝細胞的能量代謝抑制細胞凋亡基因 fas、細胞色素 C的表達,促進凋亡抑制因子 Bcl-2的表達,促進肝細胞的修復(fù),對 SAP導(dǎo)致的肝臟損害起到保護作用。

我們認為 SAP時隨著肝細胞和線粒體能量代謝障礙 fas和細胞色素 C表達明顯上升,Bcl-2的表達下調(diào),肝臟凋亡細胞數(shù)增多,肝功能進一步惡化;DADA能夠改善肝細胞及線粒體的能量代謝使細胞色素 C表達下調(diào)同時使凋亡基因 fas基因表達明顯下調(diào),而 Bcl-2基因表達明顯上調(diào),減少肝臟細胞凋亡可明顯改善肝功能。因此認為,DADA對肝功能的保護作用可能部分是通過改善肝細胞代謝,調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因 fas、細胞色素 C和 Bcl-2的表達來抑制 SAP時肝細胞的過度凋亡實現(xiàn)的。

[1]管來順,王 暉,方雪紅.急性重癥胰腺炎胰外損害 103例臨床分析 [J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2009,38(10):1298-1299.

[2]申 洪.免疫組織化學(xué)染色定量方法研究 [J].中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志,1995,4(1):89-92.

[3]IsogaiM,YamaguchiA,HoriA.et al.Hepatic histopatholo-gical changes in biliary pancreatitis[J].Am J Gastroenterol,1995,90(3):449-454.

[4]Takeyama Y,Hori Y,Takase K,et al.Apoptotic cell death of hepatocytes in rat experimental severe acute pancreatitis[J].Surgery,2000,127(1):55-64.

[5]Gallagher SF,Yang I,Baksh K,et al.Acute pancreatitis induces FasL gene expression and apoptosis in the liver[J].Surg Res,2004,122:201-209.

[6]Yang J,Gallagher SF,Haines J,et al.Kupfer cell-derived Fas ligan d plays a role in liver uryan dhepatocyte deathJ].Gastrointest Surg,2004,8:166-174.

[7]Yu XD,Wang SY,Chen GA,et al.Apoptosis induced bv depsipeptide FK228 coincides with inhibition of survival signaling in lung cancer cells[J].Cancer J,2007,13:105-113.

[8]JungJW,Cho SD,Ahn NS,et al.Augmentation of sodium butyrate-induced apoptosis by p38M AP kinase inhibition in rat liver epithelial cells[J].Antioxid Redox Sienaf,2005,7:1767-1772.

[9]何鄒駿,方馳華,朱明德.DDFA對重癥急性胰腺炎大鼠肝臟細胞凋亡及 Bax、Bcl-2基因表達的影響 [J].中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志,2006,15(2):220-224.

[10]肖經(jīng)緯.肝細胞凋亡機制及其檢測方法的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊,2006,33(2):93-96.

[11]陸倫根,曾民德,茅益民,等.二氯醋酸二異丙胺治療非酒精性脂肪性肝病的隨機雙盲臨床研究[J].中華肝臟病雜志,2005,13:92-95.

[12]朱剛劍,熊昌清,魏 端,等.二氯醋酸二異丙胺治療 36例酒精性脂肪肝療效觀察 [J].實用肝臟病雜志,2006,9(2):93-95.

[13]李小翠,李 剛,李常青.西府逐瘀湯對 D-氨基半乳糖氨所致小鼠肝損傷的保護作用 [J].陜西中醫(yī),2006,27(1):106-108.

(注:*鄧明明為本文通訊作者)