TSHR和 RASSF1A基因甲基化與乳頭狀甲狀腺癌的相關性△

南方醫科大學珠江醫院內分泌科 (廣州 510282)

戴亞麗 蔡德鴻* 陳 宏 張 振 張 樺 李 靜

腫瘤的發生與原癌基因激活和抑癌基因失活,并最終引起基因表達異常有關。基因表達異常可能通過基因機制(Genetic mechanism)和表基因機制(Epigenetic mechanism)[1]來完成。 DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾,對維持染色體的結構、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發生發展都起重要的作用,主要發生在啟動子區 CpG位點[2]。正常組織的腫瘤抑癌基因不發生甲基化,當腫瘤抑癌基因發生甲基化后,就不能正常轉錄、翻譯合成抑癌蛋白及發揮抑癌作用,細胞就有可能發生單克隆增生形成腫瘤。

乳頭狀甲狀腺癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)是甲狀腺最常見的惡性腫瘤,目前國外有研究報道甲狀腺癌的發生也與抑癌基因啟動子甲基化的發生密切相關[3],本研究選擇了兩種抑癌基因:促甲狀腺激素受體(Thyroid stimulating hormone receptor,T SHR)和 RASSF1A基因,采用甲基化特異性 PCR(Methylation-specific PCR,M SP)法 ,對 PTC及對照組織進行研究,來探討 PTC的發生機制。

對象和方法

1 研究對象 研究組為我院甲乳外科 2007～2009年收治的 50例 PTC患者(PTC組),男 15例,女35例,平均年齡 (40± 12)歲;對照組為我院甲乳外科同期收治的 32例良性甲狀腺腫瘤患者,其中結節性甲狀腺腫 20例,甲狀腺腺瘤 12例;男 9例,女 23例,平均年齡(37±12)歲。兩組均為新鮮手術標本,經病理檢查確診,標本切除后迅速轉移至-80℃冰箱保存。

2 方 法

2.1 組織 DNA的提取:使用 QIAamp DNA Mini Kits 51304基因組提取試劑盒(美國 Qiagen公司)按說明書提取基因組 DNA,紫外分光光度儀檢測其含量和純度。

2.2 DNA甲基化修飾:使用 Cp GenomeTMDNA Modification Kit S7820(CHEMICON公司 )試劑盒對提取的 DNA進行亞硫酸氫鈉處理和純化。

2.3 甲基化特異性 PCR(MSP)擴增:兩種抑癌基因的甲基化引物與非甲基化引物序列參照文獻[4,5],見表 1,由上海生工公司合成。 PCR反應體系 25 μ l,上下游引物各 1 μ l(10pmol/μ l),甲基化修飾后的 DNA 2 μ l,所 用 試 劑 盒 為 2× PCR master mix K0171(Fermentas公司)。 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR擴增產物。

兩種抑癌基因 PCR(甲基化與非甲基化)擴增條件:95℃預變性 5min,95℃變性 30s,65℃(TSHR基因)/60℃(RASSF1A基因 )退火 30s,72℃延伸 30s,循環 30個周期,最后 72℃延伸 5min。

2.4 抑癌基因克隆及測序:每個抑癌基因各隨機選取 2例 PTC及 2例對照組織(均包含甲基化標本及未甲基化標本各 1例),首先進行 PCR擴增,克隆后再測序。

2.5 統計學方法:采用 SPSS13.0統計軟件,以Pearsoni2檢驗分析兩個抑癌基因 PTC組與對照組間甲基化差別;PTC組 TSHR與 RASSF1A基因甲基化的相關性用 Spearman相關分析;以 Pearsoni2檢驗分析 PTC組兩個抑癌基因啟動子甲基化和主要的臨床病理參數的關系,P＜0.05為有統計學差異。

表1 PCR所用引物序列及片段大小

結 果

1 兩種抑癌基因啟動子甲基化分析:PTC患者中,發現 34/50例(68.0%)TSHR基因、30/50例(60.0%)RASSF1A基因啟動子發生了甲基化;對照組患者中,7/32例(21.9%)TSHR基因、10/32例(31.3%)RASSF1A基因啟動子發生甲基化;PTC組 TSHR基因和 RASSF1A基因啟動子甲基化率均顯著高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)(圖 1,2)。

圖1 TSHR基因啟動子 M SP電泳圖(Marker:100bp DN A標記物,K、L:PTC組,Y、W:對照組,U:非甲基化條帶,M:甲基化條帶)

圖2 RASSF1A基因啟動子 M SP電泳圖(Marker:100 bp DN A標記物,K、L、M、N、O、Q:乳頭狀甲狀腺癌,上排 U、Y、Z:對照組織標本,下排 U:非甲基化條帶,M:甲基化條帶)

圖3 測序圖(TSHR基因啟動子甲基化者 CpG島中的 C仍為 C,未甲基化者 C均轉變為 T)

2 測序結果:兩個基因啟動子發生了甲基化的,其所有 CpG位點堿基均發生了改變,即甲基化引物擴增產物中的 CpG位點的 C仍然保持 C,而非甲基化引物擴增產物中的 CpG位點中的 C轉變為 T(圖 3,4)。

3 PTC組 TSHR和 RASSF1A基因甲基化間的關系:PTC組織中 TSHR和 RASSF1A基因啟動子均甲基化的為 26/50;TSHR甲基化而 RASSF1A基因未甲基化的為 8/50;TSHR未甲基化而 RASSF1A基因甲基化的為 4/50;TSHR和 RASSF1A基因啟動子均未甲基化的為 12/50。計算 r=0.490(P=0.000),提示 PTC組 TSHR和 RASSF1A兩個抑癌基因甲基化之間存在顯著相關性。

4 兩個抑癌基因甲基化與患者臨床病理資料之間的關系:結合患者的臨床病理資料,TSHR和RASSF1A基因甲基化與患者的年齡、性別、臨床分期均未見相關性;TSHR基因與患者是否伴有淋巴結轉移相關,RASSF1A基因與患者是否伴有淋巴結轉移無關 ,見表 2。

圖4 測序圖(RASSF1A基因啟動子甲基化者 CpG島中的 C仍為 C,未甲基化者 C均轉變為 T)

表2 兩個抑癌基因啟動子甲基化和主要臨床病理參數的關系

討 論

表基因機制主要指 DNA 5’CpG島胞嘧啶甲基化改變[1],引起基因表達異常。腫瘤中 DNA甲基化異常表現為基因中散在的 CpG位點甲基化普遍下降和區域性 CpG島高甲基化并存及細胞總的甲基化能力升高。目前人們已在多種腫瘤(乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、腎癌、鼻咽癌等)的發生中證實抑癌基因啟動子區的甲基化與腫瘤的發生密切相關[6],有關甲狀腺腫瘤與抑癌基因甲基化的關系,國外也有相關報道。

Jason等[5]對 32例 PTC患者和 27例對照組采用MSP方法進行研究,發現 T SHR在癌組織的甲基化率為 34%,在對照組中為 7%,兩者存在顯著統計學差異,并且在甲狀腺癌組發現了 TSHR甲基化的腫瘤復發率高,未發生甲基化的腫瘤復發率低,他們認為抑癌基因啟動子區的甲基化是甲狀腺癌的一個惡性標記。Schagdarsurengin等[7]采用 MSP法 ,對 13例 PTC,10例濾泡型甲狀腺癌,9例未分化甲狀腺癌,6例髓樣甲狀腺癌,12例結節性甲狀腺腫及 10例濾泡型腺瘤進行研究,發現 PTC患者 TSHR啟動子甲基化率為58%,未分化甲狀腺癌為 86%,而在對照組達到 80%,T SHR啟動子甲基化率僅在未分化癌中較其他甲狀腺癌高。唐建東[8]等用 M SP法在 PTC組織中發現RASSF1A基因啟動子甲基化的發生率為 55.9%(19/34),癌旁組織中甲基化的發生率為 23.5%(8/34),認為甲基化可能與 PTC發生發展有關。

我們使用 MSP法,檢測了 50例 PTC和 32例對照 TSHR和 RASSF1A基因啟動子甲基化情況,發現了兩種抑癌基因啟動子的甲基化頻率在 PTC中明顯高于對照組(P＜0.05);測序結果證實了兩個基因啟動子 CpG島的所有 CpG位點均發生了甲基化。有研究發現多個抑癌基因啟動子甲基化在腫瘤的發生發展中有協同作用,多個抑癌基因甲基化對信號轉導通路的影響可能較單一基因甲基化更為重要[5]。我們進一步對兩種抑癌基因甲基化之間相關性進行分析,發現T SHR和 RASSF1A之間存在關聯性,這可能是由于兩種抑癌基因的作用環節相同:TSHR基因和RASSF1A基因都主要作用于信號傳導[9]。 PTC組兩種抑癌基因啟動子甲基化,均與腫瘤的臨床分期無關,提示兩種抑癌基因啟動子甲基化可能在甲狀腺腫瘤的早期階段既已發生;但 TSHR基因啟動子甲基化率在有淋巴結轉移的 PTC高于無淋巴結轉移的病例,提示該抑癌基因啟動子甲基化在甲狀腺癌的惡性進展中可能發揮一定作用。僅從我們的研究結果表明,在 PTC中兩種抑癌基因啟動子的高甲基化可能抑制了抑癌基因的表達,使得抑癌基因對 PTC的抑制作用減少,從而促進了 PTC的發生和發展,另 TSHR基因和RASSF1A基因在 PTC的發生中可能起到協同作用。因此,我們的研究提供了證據:在 PTC中異常的抑癌基因啟動子甲基化可能是抑癌基因沉寂的一個重要機制。

總之,我們在 PTC的研究顯示了 TSHR和RASSF1A兩種基因異常的甲基化在 PTC中是一種較普遍的現象,可能是基因沉寂的一個潛在分子通路,與 PTC的發生、發展有一定聯系。雖然 DNA甲基化是一個復雜的過程,許多細節尚未明了,但隨著對這一領域研究的深入以及對于腫瘤發生機制的逐漸明釋,我們相信它對于腫瘤早期預測與干預以及預后評估等將會有重要作用。

[1]Byun DS,Lee M G,Chae KS,et al.Frequent epigenetic inactivation of RASSF1A by aberrant promoter hypermethylation in human gastric adenocarcinoma[J].Cancer Res,2001,61(19):7034-7038.

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[4]Jason A,Chun-Yang Fan,ChunlaiZou,etal.Methylation status of genes in papillary thyroid carcinoma[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2007,133(10):1006-1011.

[5]Schagdarsuregin U,Gimm O,Cuong Hoang-Vu C,et al. Frequent epigenetic silencing ofthe CpG island promoter of RASSF1A in thyroid carcinoma[J].Cancer Res,2002,62(12):3698-3701.

[6]劉桂芝,吳逸明,楊繼要,等.非小細胞肺癌組織中RASSF1A和 P16基因啟動子甲基化研究 [J].陜西醫學雜志,2007,5(36):515-520.

[7]Schagdarsurengin U,Gimm O,Dralle H,et al.CpG island methylation of tumor-related promoters occurs preferentially in undifferentiated carcinoma[J].Thyroid,2006,16(7):633-642.

[8]唐建東,歐陽軍,栗夏蓮,等.甲狀腺乳頭狀癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化與臨床病理學的關系 [J].天津醫藥,2007,35(12):887-889.

[9]Tommasi S,Dammann R,Jim SG,et al.RASSF3 and NORE1: identification and cloing of two human homologuesoftheputativetumorsuppressorgene RASSF1[J].Oncogene,2002,21(17):2713-2720.