咪達唑侖對子宮平滑肌細胞鈣離子移動的影響△

南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院麻醉科(深圳 518028)

黃穗萍 黃曉雷 李元濤▲ 曹 君 孟 馨 蘇嬌玲 胡 薇

研究表明[1]咪達唑侖可濃度依賴性地抑制孕和未孕大鼠子宮平滑肌收縮,但其抑制子宮收縮的作用機制仍不清楚。子宮平滑肌細胞內游離 Ca2+是肌肉興奮-收縮偶聯的活化劑,與肌動蛋白、肌漿蛋白的結合引起子宮收縮[2,3]。而咪達唑侖抑制子宮平滑肌收縮是否與影響子宮平滑肌細胞內外游離 Ca2+移動有關呢?因此本研究擬采用 Fluo-3AM鈣熒光指示劑測鈣技術,觀察不同濃度的咪達唑侖對足月產婦子宮平滑肌細胞內外 Ca2+跨膜內流和肌漿網 Ca2+釋放功能的影響,探討其對子宮收縮影響的可能機制。

材料與方法

1 實驗材料 經醫院倫理委員會批準,取孕足月健康產婦子宮平滑肌組織,約 0.5cm×0.5cm×1.5cm大小;實驗用 DMEM購于杭州吉諾生物醫藥技術有限公司;胎牛血清購于上?？蠌娰Q易有限公司;氯化鉀購于湖北清大康迪藥業有限公司生產;0.2%Ⅱ型膠原酶、0.2%胰蛋白酶及咖啡因購于美國 Sigma公司;酯化形式的Fluo-3AM購于美國Molecular Prob公司;細胞觀察顯微鏡采用日本 Olympus IX 70顯微鏡;鈣熒光強度測定采用德國 Zeiss公司 LSM-510激光共聚焦顯微鏡。

2 實驗方法 將子宮平滑肌組織于無菌條件下快速送實驗室,用75%酒精沖洗兩遍,再用 PBS沖洗 3遍后剪碎和洗滌,加入適量的 0.2%Ⅱ型膠原酶(DM EM+Ⅱ型膠原酶),37℃水浴震蕩消化 4～ 5h,加入完全 DMEM培養液(80%DMEM+20%胎牛血清)DMEM培養液(DMEM+10%胎牛血清+青霉素100IU/ml+鏈霉素 100 μ g/ml)終止消化,用吸管反復輕輕吹打、過濾、離心、去上清液,將離心所得細胞加入適量完全 DMEM培養液充分混勻,接種于底面積為25cm2培養瓶中,置 37℃,100%飽和濕度和 5%CO2培養箱中培養。培養30h后第1次換液,以后每兩天換液1次,并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。細胞共計生長 10d后用0.2%胰蛋白酶消化后平均分別置于 12孔板中。

第一部分 將子宮平滑肌細胞在室溫下用100mmol/L酯化形式的 Fluo-3AM染色 60min后,用Hank液浸洗去細胞外殘余熒光染色劑,在相差顯微鏡下挑選活性良好的子宮平滑肌細胞進行實驗。40個孔板中活性良好的子宮平滑肌細胞隨機等分為 4組(n=10):對照組、低濃度咪達唑侖組(M1組)、中濃度咪達唑侖組(M2組)、高濃度咪達唑侖組(M3組),用 LSM-510激光共聚焦顯微鏡測定反映游離 Ca2+濃度的細胞內鈣熒光強度(激發波長 488nm,發射波長 505nm),測定鈣熒光強度的基礎值后,分別給予 Hank’s液、終濃度 為 1 μ mol/L、 3 μ mol/L、 15 μ mol/L 咪 達 唑 侖處 理20min后再測定鈣熒光強度,然后加入氯化鉀(批號:H42020421),同時每隔 10s掃描一幅記錄鈣熒光強度峰值。每個孔板在激光共聚焦顯微鏡下隨機選定10個子宮平滑肌細胞,利用圖形分析軟件分析細胞內鈣熒光強度,記錄峰值后取平均值。

第二部分以咖啡因(終濃度 20mmol/L)代替氯化鉀,其余同第一部分。

結 果

1 子宮平滑肌細胞培養及熒光染色子宮平滑肌細胞圖 見圖 1～3。

2 游離Ca2+濃度測定結果 見表1～ 2。第一部分與基礎值比較:各組加入咪達唑侖后鈣熒光強度無顯著性差異(P＞0.05),但加入氯化鉀后鈣熒光強度升高(P＜0.01);M1組與對照組加入氯化鉀后鈣熒光強度無顯著性差異(P＞0.05),M2組與 M3組加入氯化鉀后鈣熒光強度峰值低于對照組(P＜0.01),且 M3組低于 M2組(P＜0.05)。第二部分與基礎值比較,各組加入咪達唑侖后鈣熒光強度無顯著性差異(P＞0.05),加入咖啡因后鈣熒光強度升高(P＜0.01);加入咖啡因后各組鈣熒光強度無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 子宮平滑肌細胞 (×40)

圖2 熒光染色子宮平滑肌細胞(×40)

圖3 圖形分析軟件所示結果

表1 咪達唑侖對氯化鉀誘發子宮平滑肌細胞鈣離子熒光強度峰值變化的影響(n=10,±s)

表1 咪達唑侖對氯化鉀誘發子宮平滑肌細胞鈣離子熒光強度峰值變化的影響(n=10,±s)

※注:與基礎值比較,* P＜0.01;與對照組比較,△ P＜0.01;與 M1組比較,#P＜0.01;與 M2組比較,※ P＜0.01

組 別 基礎值 預處理后 氯化鉀誘發對照 組 80.11± 8.02 81.56± 8.10 180.31± 13.87*M1組 80.45± 7.98 81.78± 9.21 159.75± 12.39* △M2組 81.49± 9.01 80.95± 9.33 140.71± 12.31* △#M3組 79.67± 8.27 82.38± 9.61 121.75± 11.03* △#

表2 咪達唑侖對咖啡因誘發子宮平滑肌細胞鈣離子熒光強度峰值變化的影響(n=10,±s)

表2 咪達唑侖對咖啡因誘發子宮平滑肌細胞鈣離子熒光強度峰值變化的影響(n=10,±s)

注:與基礎值比較,* P＜0.01

組 別 基礎值 預處理后 咖啡因誘發對照 組 81.75± 7.94 81.41± 5.16 121.64± 10.33*K1組 79.58± 9.24 82.07± 9.23 122.64± 12.07*K2組 83.35± 7.90 82.84± 6.17 121.54± 11.71*K3組 83.11± 7.997 82.35± 6.16 120.95± 11.32*

討 論

細胞內鈣離子([Ca2+]i)作為第二信使,對細胞、組織、器官及整個生命系統的功能具有非常重要的影響。 [Ca2+]i濃度的變化,是諸多生理和病理變化的起動和發展的重要中介因素。子宮收縮的動因來自內源性催產素和前列腺素的釋放。催產素可促進鈣離子向肌細胞內移動,前列腺素是鈣離子的載體,其與鈣離子形成復合體并將其帶入肌細胞內。細胞內游離鈣離子是肌肉興奮-收縮偶聯的活化劑,與肌動蛋白、肌漿蛋白的結合引起子宮收縮與縮復,使肌纖維間子宮血管受壓而迂曲閉塞,加之內源性前列腺素作用下血小板的聚集、凝固加強,參與并引發凝血和血栓形成,堵塞胎盤剝離面處子宮血管,從而完成分娩的自然止血?？梢娝杏绊懽訉m平滑肌細胞內外鈣離子移動的因素都有可能干擾子宮收縮,導致產后出血。 Gursoy等[4]發現吸入麻醉藥抑制妊娠子宮平滑肌收縮性與鈣離子活動有關。 Tsujiguchi等[5]發現丙泊酚抑制縮宮素誘發的孕鼠子宮平滑肌收縮,其可能機制是丙泊酚抑制孕鼠子宮平滑肌細胞膜上的鈣通道導致鈣內流減少。Yamakage等[6]發現咪達唑侖通過抑制細胞膜上的鈣通道,降低細胞內鈣引起犬氣道平滑肌松弛。因此我們推測咪達唑侖可能影響子宮平滑肌細胞內、外 Ca2+移動而影響子宮收縮。

咪達唑侖是一種具有較強鎮靜、順行性遺忘作用的靜脈全麻藥,對呼吸循環系統影響較輕,廣泛應用于臨床麻醉,其臨床誘導峰濃度為3 μmol/L。參照李繼昌等[7]研究咪達唑侖對大鼠心肌細胞內鈣離子的影響,本研究選擇 1、3、15 μ mol/L 3種濃度的咪達唑侖預處理子宮平滑肌細胞進行實驗。

Fluo-3AM是一種高度特異性的 Ca2+熒光探針,進入細胞后經水解去掉乙酸甲酯(AM)成為 Fluo-3。Fluo-3在無 Ca2+存在時基本不發熒光.而與細胞內游離 Ca2+結合后.其熒光強度明顯增強.因此細胞內熒光強度的改變可靈敏地反映細胞內游離 Ca2+濃度的變化。細胞內有游離鈣和結合鈣兩種 Ca2+存在,游離鈣的濃度 [Ca2+]i受 Ca2+跨膜轉運和細胞內鈣庫的 Ca2+動員影響。理論上高濃度的氯化鉀可促使細胞膜去極化,細胞膜上電壓依賴性鈣通道開放,鈣離子跨膜內流,使 [Ca2+]i升高而產生相應的效應[8]。而咖啡因為動員 Ryanodine型鈣釋放而使 [Ca2+]i升高[9]。本研究參照李元濤等[10]實驗,選擇 40mmol/L的氯化鉀和20mmol/L的咖啡因誘發子宮平滑肌細胞 [Ca2+]i升高,觀察不同濃度的咪達唑侖對其鈣離子移動變化的影響。

本研究第一部分各組加入 40mmol/L氯化鉀后,細胞內鈣熒光強度迅速升高,提示氯化鉀可引起子宮平滑肌細胞內鈣離子濃度的升高。氯化鉀引起的鈣離子濃度升高與細胞內鈣釋放及細胞膜上的受體無關,主要源于細胞外高濃度的鉀離子對細胞膜外向鉀電流的抑制導致細胞膜的去極化,從而激活了 L-型電壓依賴性鈣通道(L-VDCC),繼而引起細胞外 Ca2+的跨膜內流,從而導致細胞內 Ca2+濃度升高[11]。 K1組結果顯示,預先應用 30 μ mol/L的咪達唑侖后,氯化鉀引起的Ca2+濃度升高幅度無明顯變化,但 K2、K3組結果顯示,預先應用 100 μ mol/L、300 μ mol/L的咪達唑侖后 ,氯化鉀引起的 Ca2+濃度升高幅度明顯變小,且 K3組明顯小于K2組。由于L-VDCC是氯化鉀引起的細胞內Ca2+濃度升高的主要途徑,由此推測,低濃度咪達唑侖對子宮平滑肌細胞膜上的 L-VDCC無抑制作用,而中、高濃度咪達唑侖可能對子宮平滑肌細胞膜上的 L-VDCC存在一定程度的抑制作用,其抑制作用呈濃度依賴性。

第二部分各組加入 20mmol/L咖啡因后,細胞內鈣熒光強度升高,提示咖啡因可引起子宮平滑肌細胞內Ca2+濃度的升高,咖啡因是細胞內Ca2+釋放劑,可引起肌漿網釋放 Ca2+,各組預先應用咪達唑侖后,咖啡因引起的Ca2+濃度升高幅度無明顯變化,由此推測,咪達唑侖對子宮平滑肌細胞內肌漿網 Ca2+釋放功能無明顯影響。

我們推測咪達唑侖可能通過抑制子宮平滑肌細胞膜上 L-VDCC,減少 Ca2+內流,降低細胞內游離 Ca2+濃度,影響子宮平滑肌細胞收縮。而咪達唑侖對子宮平滑肌細胞膜上的受體門控通道(ROC)、鈣庫控制通道(SOC)等 Ca2+通道的影響有待于進一步研究。

綜上所述,高濃度咪達唑侖可明顯抑制人子宮平滑肌收縮,可能會引起宮縮乏力,導致產后出血,因此產科麻醉避免使用高濃度的咪達唑侖,尤其是存在有宮縮乏力高危因素的產婦。

[1]李子剛,湯慧芳,陳季強.地西泮與咪達唑侖對離體大鼠子宮平滑肌收縮的影響 [J].中國藥理學與毒理學雜志,2006,20(5):372-376.

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