PTEN基因在哮喘患者中的表達及地塞米松對其調節作用的研究﹡

倪振華 陳 果 陳清閣 王雄彪▲

1.上海市普陀區中心醫院實驗中心，上海 200062；2.上海市普陀區中心醫院呼吸科，上海 200062

支氣管哮喘是一種常見病，其患病率不低，并有逐漸增高的趨勢[1]。第10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失的基 因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是近年來新發現的一個與哮喘發病相關的基因[2]，目前已證明在OVA誘發的哮喘大鼠模型中，PTEN蛋白表達和活性均降低，而給予糖皮質激素地塞米松治療能促進PTEN的表達，抑制炎性細胞因子的分泌[3]。但是目前關于PTEN基因與哮喘的發病關系以及地塞米松對其的調節研究主要集中在哮喘動物上，盡管PTEN基因在人和鼠中高度同源，但是否在哮喘患者中也存在類似的關系，目前與此相關的研究國內外尚無報道。因此本研究擬通過測定哮喘患者和非哮喘患者氣道黏膜組織中PTEN基因的表達變化，探討PTEN在人哮喘發病中的關系，通過采用人氣道上皮細胞A549探討地塞米松對PTEN的表達調節，揭示地塞米松治療哮喘的新途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年6月～2011年6月上海市普陀區中心醫院收住院的5例支氣管哮喘患者作為研究對象，其中男4例，女1例，年齡30～45歲，均符合中華醫學會制定的支氣管哮喘診斷標準，所有患者于入選前1個月內均未使用糖皮質激素治療。正常對照組選取住院的非哮喘患者，其中男4例，女2例，年齡30～45歲。氣道黏膜組織取自支纖鏡黏膜活檢。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒購購自Qiagen公司，逆轉錄試劑盒購自Invitrogen公司，引物和探針由上海閃晶公司合成，熒光定量PCR試劑購自Roche公司。人氣道上皮細胞A549購自中科院細胞所。地塞米松購自上海醫藥（集團）有限公司信誼制藥總廠。

1.3 方法

1.3.1 熒光定量PCR檢測PTEN基因的表達 RNA 的提取采用Qiagen公司的RNeasy Micro Kit 試劑，按說明書操作方法進行。cDNA合成采用Invitrogen公司SuperScript Ⅲ第一鏈合成試劑盒，按說明書操作方法進行。熒光定量PCR反應試劑采用 Roche公司 PCR master mix，反應條件為：94℃ 10 min，94℃30 s，60℃ 1 min，共40個循環，ABI7300全自動熒光定量PCR儀（美國ABI公司），以GAPDH基因作為內參，引物和探針序列 如 下：PTEN-F 5- GGGACGAACTGGTGTAATGATATG-3；PTEN-R 5- ATAGCGCCTCTGACTGGGAATAG-3；PTEN-Probe 5-fam- CCCTTTTTGTCTCTGGTCCTTACTTCCCC-tamra-3；GADPH-F 5- CCACTCCTCCACCTTTGAC-3；GADPH-R 5- ACCCTGTTGCTGTAGCCA -3；GADPH-Probe：5-fam- TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-tamra-3。

1.3.2 細胞培養 人氣道上皮細胞A549用RPMI-1640培養液（含10%小牛血清），在37℃、5% CO2的條件下培養，隔天換液。取對數生長期細胞，用1640培養基制成細胞懸液 （1×l06個/mL ）加入6孔板，2 mL/孔，培養24 h后給不同濃度的地塞米松處理。

1.4 統計學處理

采用REST-XL軟件和統計學軟件SPSS11.0作為基因表達的相對定量統計學分析[4]，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTEN基因在哮喘患者中的表達情況分析

本實驗共提取5例哮喘患者和6例非哮喘患者氣道黏膜組織的RNA，采用熒光定量PCR檢測了PTEN基因的表達情況，實驗結果通過REST軟件分析顯示PTEN基因在哮喘患者中的表達低于非哮喘患者（下降3.784倍），兩組的差異具有統計學意義（P ＜ 0.05）。

2.2 地塞米松對PTEN的表達調節

分別采用不同濃度的地塞米松（10-5M、10-6M、10-7M和 10-8M）處理A549細胞24 h，提取RNA后采用熒光定量PCR檢測PTEN基因的表達情況，結果顯示地塞米松能上調PTEN基因的表達水平，呈濃度依賴性（P＜0.01，圖1A）。再以10-5M濃度的地塞米松分別處理A549細胞24、48、72和96 h，結果顯示隨著地塞米松處理時間的延長，PTEN基因的表達逐步上升，具有一定的時間依賴性（P＜ 0.01，圖 1B）。

圖1 地塞米松處理A549細胞對PTEN表達的影響，A：不同濃度的地塞米松（10-5M、10-8M）處理A549細胞24 h；B：10-5M濃度的地塞米松處理A549細胞24～96 h。與對照組比較，*P ＜0.01

3 討論

第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因（PTEN）是于1997年發現的一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，研究發現PTEN不僅與肺癌的發生、發展關系密切，與其他呼吸系統疾病，如支氣管哮喘等也有一定關系。在卵蛋白（OVA）誘發的哮喘小鼠模型中，PTEN蛋白表達和活性均降低。在給予PI3K抑制劑或PTEN腺病毒cDNA后，可明顯減少氣道炎癥[2]，即上調PTEN表達能治療哮喘。在過敏原誘發的哮喘小鼠模型給予PPAR-r促效劑或PPAR-r腺病毒后，PTEN表達上調。通過測量Akt磷酸化水平的減少發現該上調與PI3K活性降低有關[5]。該實驗表明PPAR-r在哮喘發病學中，通過調節PTEN表達而起到保護作用。本實驗結果顯示在哮喘患者的氣道黏膜組織中PTEN的表達也是下調的，與動物實驗的結果一致，進一步說明PTEN在哮喘發病中發揮了重要作用，PTEN可以作為哮喘治療靶點之一。

糖皮質激素地塞米松在治療哮喘方面的一線作用已毋庸置疑，其可抑制多種炎癥細胞的活化和炎癥因子的生成及釋放，降低血管通透性，提高β2受體的敏感性，對于哮喘的急性炎癥及慢性氣道重塑都有肯定的療效。研究發現地塞米松治療哮喘大鼠后，PTEN表達明顯上調，提示地塞米松可能通過調節PTEN的表達從而發揮哮喘治療的作用。本實驗也在人氣道上皮細胞上證實地塞米松能上調PTEN的表達，本研究結果顯示地塞米松治療哮喘的新途徑。

綜上所述，通過檢測哮喘動物和哮喘患者中PTEN基因的表達情況揭示了PTEN在哮喘發病機制中的重要作用，正向調控PTEN可能是哮喘治療的新途徑。

[1] Akinbami LJ,Moorman JE,Liu X.Asthma prevalence， health care use， and mortality: United States,2005-2009[J].Natl Health Stat Report,2011,（32）:1-14.

[2] Lee YC.The role of PTEN in allergic inflammation[J].Arch Immunol Ther Exp,2004,52（4）:250-254.

[3] 徐慧，戴元榮，曾濰顯，等. PTEN在哮喘大鼠肺部的表達及地塞米松的干預[J].中國臨床藥理學與治療學，2009，8：872-877.

[4] Pfaffl MW,Horgan GW,Dempfle L. Relative expression software tool（REST）for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR[J].Nucleic Acids Res,2002,30（9）:e36.

[5] Carracedo A,Pandolfi PP. The PTEN-PI3K pathway： of feedbacks and crosstalks[J]. Oncogene,2008,27（41）:5527-5541.