海洋厭氧反硝化細菌Pseudomonas stutzeri抗菌活性物質的研究

顧曉潔，穆軍，張翼，梁羽甜，李文

(大連交通大學 環境與化學工程學院，遼寧 大連 116028)＊

0 引言

由微生物引起的感染性疾病是我國最常見的疾病.隨著感染性疾病發病率的上升和各類抗生素新藥的不斷涌現，臨床治療急需的新型抗感染藥物將成為醫藥市場上增長新熱點.海洋細菌中蘊藏著許多具有生物活性的新化合物，是開發新藥的寶貴資源，在眾多的海洋細菌活性代謝產物中，抗微生物活性一直受到廣泛的關注，因而篩選抗菌活性化合物產物已成為藥物研發的重要方面［1-2］.

從海洋底泥中分離海洋厭氧細菌具有取材方便、細菌種類豐富的特點.然而，目前大多數具有抗菌生物活性的海洋細菌主要從海洋動物、植物體表或者體內分離得到，直接從海洋底泥中進行具有抗菌生物活性的海洋厭氧細菌分離與鑒定的研究則少有報道［3］.反硝化細菌多屬革蘭氏陰性細菌，是指能引起反硝化作用的細菌.迄今為止，對于反硝化細菌的研究僅限于土壤［4］、大氣［5］、污水處理［6］、水產養殖［7］和菌株的分離、鑒定與活性篩選［8］五方面.

圖1 化合物1-4的結構式

本文以海洋厭氧反硝化細菌Pseudomonas stutzeri(No.DN7)的次生代謝產物為研究對象，從其乙酸乙酯部分得到4個活性單體化合物(結構式見圖1)，并對其進行鑒定和抗菌活性測試，為今后更多活性成分的制備分離奠定了基礎，對新抗生素的篩選及新藥的開發也具有重要的意義.

1 實驗方法

1.1 材料、試劑與儀器

研究所用菌株于2007年10月從中國渤海海域的海洋底泥中分離獲得.經大連交通大學資源與環境生物技術研究所穆軍教授鑒定為Pseudomonas stutzeri(No.DN7)，已于2008年10月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為:CGMCC No.2732.活性指示菌:銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)購自中國科學院微生物研究所.

所用試劑除供高效液相色譜分析用甲醇之外，均為分析純.

SDJ-超凈工作臺(上海博訊醫療設備廠)，SPX-250B型生化培養箱(上海躍進醫療器械廠)，三用紫外分析儀(上海精科實業有限公司)，Thermo Scientific Multiskan Ascent型酶標儀(上海賽默飛世爾科技公司)，P230型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)，C18-HPLC柱(Hypersil 5 μm 填料，4.6 mm ×250 mm，大連依利特分析儀器有限公司)，EI-MS譜用JMSD300型質譜儀，Bruker AC2300型核磁共振儀(德國Bruker公司)).

1.2 提取與分離

100 L菌株發酵液濃縮至5 L，依次用等體積乙酸乙酯、正丁醇萃取.乙酸乙酯萃取部分去除溶劑得到固體約5.6 g.正丁醇萃取部分濃縮去除正丁醇，甲醇溶解后抽濾，棄去不溶物，反復3次脫去無機鹽，合并濾液濃縮至干得到固體約27.1 g.對乙酸乙酯部分進行ODS硅膠柱層析，依次用30%、50%、70%、90%、100%甲醇洗脫.采用紙片法模型篩選層析各組份的抗菌活性［8］，發現30%、70%甲醇洗脫部分具有明顯活性(見附表).30%甲醇洗脫部分HPLC色譜分離條件:檢測器 UV，柱溫 25℃，流速 1 mL/min，波長 =254 nm，流動相為甲醇－水=30%，收集時間為20.1 min，得到化合物 1(5 mg);收集時間 25.9 min，得到化合物2(3 mg).70%甲醇洗脫部分HPLC色譜分離條件:檢測器UV，柱溫 25℃，流速1 mL/min，波長=254 nm，流動相為甲醇－水=70%，收集時間為16.6 min，得到化合物3(5 mg);收集時間18.1 min，得到化合物4(4 mg).

附表 DN7樣品各組分抑菌圈直徑 mm

1.3 單體化合物的活性評價

化合物1-4配制成所需濃度的甲醇溶液，按照濃度高低依次加入96孔板，45℃減壓揮干.用無菌生理鹽水將銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別制成0.5麥氏濁度菌懸液.精密吸取20 μL的菌懸液加入裝有20 mL液體M-H培養基的三角瓶中稀釋1000倍，在96孔板每孔中加入100 μL稀釋液，35℃培養16～24 h.每個樣品均做3次平行實驗.用酶標儀在595 nm和630 nm處測定其吸光度值，測定完畢后，每空加入25 μL 5 mg/mL MTT(四氮唑藍)溶液染色，20 min后在540 nm處再次測定吸光度值.通過公式:抑菌率(%)=(陰性對照OD值－樣品OD值)/陰性對照OD值×100，計算化合物1～4在540 nm處的抑菌率(見圖2～5).

圖2 化合物1的抑菌率

圖3 化合物2的抑菌率

圖4 化合物3的抑菌率

圖5 化合物4的抑菌率

2 結構鑒定

化合物1:淡黃色針晶.EI-MS(m/z):145(M+)，144(M+-H，100%).1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.29(2H，m，H-5，6)，7.47(1H，dd，J=5.3 Hz，3.7 Hz，H-7)，7.85(1H，d，J=2.8 Hz，H-2)，8.23(1H，dd，J=5.3 Hz，3.4 Hz，H-4)，8.83(1H，b，NH)，9.97(1H，s，CHO).13C NMR(125 MHz，MeOD)δ:187.4(CHO)，139.6(C-2)，122.4(C-4)，123.6(C-6)，125.0(C-5)，113.1(C-7).以上數據與文獻［9］報道一致，故確定化合物1為3-吲哚甲醛.

化合物2:無色針晶.EI-MS(m/z):152(M+)，151(M+-H，100%).1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ:7.72(2H，dd，J=3.3，5.7 Hz，H-2，H-6)，7.52(2H，dd，J=3.3，5.7 Hz，H-3，H-5)，3.9(3H，s，-OCH3).13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:160.9(C-7)，132.7(C-1)，131.9(C-4)，131.1(C-3)，131.1(C-5).以上數據與文獻［10］報道基本一致，故鑒定化合物2為對羥基苯甲酸甲酯.

化合物3:白色固體.EI-MS(m/z):278(M+)，277(M+-H，100%).1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.74(2 H，m，H-3，6)，7.60(2 H，m，H-4，5)，4.08(4 H，d，J=6.8 Hz，H-1'，1″)，2.04(2 H，J=6.7 Hz，H-2'，2″)，0.99(12H，d，J=6.8 Hz，H-3'，3″，4'，4″).13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:169.3(C-7，8)，133.6(C-1，2)，132.4(C-4，5)，130.0(C-3，6)，72.9(C-1'，1″)，28.9(C-2'，2″)，19.4(C-3'，3″，4'，4″).以上數據與文獻［11］報道一致，故確定化合物3為鄰苯二甲酸二異丁酯.

化合物4:白色固體.EI-MS(m/z):278(M+)，277(M+-H，100%).1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.73(2 H，m，H-3，6)，7.60(2 H，m，H-4，5)，4.29(4 H，t，J=6.7 Hz，H-1'，1″)，1.72(4 H，J=7.2 Hz，，H-2'，2″)，1.45(4 H，J=7.4 Hz，H-3'，3″)，0.98(6 H，t，J=7.5 Hz，H-4'，4″).13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:169.3(C-7，8)，133.6(C-1，2)，132.3(C-4，5)，129.9(C-3，6)，66.7(C-1'，1″)，31.7(C-2'，2″)，20.2(C-3'，3″)，14.0(C-4'，4″).以上數據與文獻［12］報道一致，故確定化合物4為鄰苯二甲酸二正丁酯.

3 結論

本文采用抗菌活性追蹤的方法，首次從海洋厭氧反硝化細菌Pseudomonas stutzeri(No.DN7)次生代謝產物的乙酸乙酯部分分離并鑒定了4個活性單體化合物.同時，應用MTT法對化合物1-4進行活性評價，研究結果表明化合物3、4具有較好的枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌活性，化合物1、2的抑菌活性一般.該結論為今后更多活性成分的制備分離奠定了基礎，對新抗生素的篩選及新藥的開發也具有重要的意義.

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