鈣通道阻滯劑對大鼠坐骨神經(jīng)損傷后局部膠原蛋白沉積的影響

薛金偉 凌 麗

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000)

周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)無疑是顯微外科的一道難題，影響其功能恢復(fù)的因素是多方面的，其中最常見的抑制因素是神經(jīng)吻合口膠原纖維增生所形成的創(chuàng)傷性神經(jīng)瘢痕。它在神經(jīng)束內(nèi)會形成物理性屏障，阻礙軸索的延伸〔1〕;在神經(jīng)系膜及外膜則形成組織粘連，阻礙神經(jīng)正常滑動。當(dāng)肢體運動帶動神經(jīng)滑動時，局部粘連及神經(jīng)纖維波浪狀結(jié)構(gòu)喪失，又會使神經(jīng)伸展能力降低，這樣縱向的拉力集中于損傷局部轉(zhuǎn)化成垂直于神經(jīng)干的環(huán)向壓力，造成機械性卡壓，阻斷神經(jīng)血運及軸突的運輸，導(dǎo)致髓鞘變性、軸突斷裂，影響神經(jīng)功能恢復(fù)。可見，減輕及軟化神經(jīng)瘢痕，降低粘連，能在很大程度上改善神經(jīng)的恢復(fù)情況〔2〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)鈣通道阻滯劑可抑制成纖維細(xì)胞增殖，降低膠原的合成和分泌，對瘢痕形成有良好的抑制作用〔3，4〕。本文應(yīng)用這一研究瘢痕的模型和方法，觀察了維拉帕米對神經(jīng)損傷處瘢痕形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 選用清潔級2月齡雄性SD大鼠120只，健康，體重220～250 g，制作大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷模型，實驗組每天腹腔注射維拉帕米注射液4 mg/kg〔5〕，對照組每日腹腔注射等量生理鹽水。術(shù)后第2天隨機分成實驗組和對照組，每組分成4 w、12 w兩個時相，每個時相點30只大鼠。

1.1.2 主要實驗藥品和試劑 鹽酸維拉帕米注射液，Ⅰ、Ⅲ型膠原單克隆抗體，免疫組化(SABC法)試劑盒。羥脯氨酸測試盒和考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，生效后俯臥位固定，無菌條件下顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下緣1 cm處鋒利刀片橫行切斷坐骨神經(jīng)，以神經(jīng)外膜上的血管走行為標(biāo)記，立即用9-0無損傷縫合線行神經(jīng)外膜端端吻合術(shù)，吻合口均勻縫合6針。逐層閉合創(chuàng)口，術(shù)后第2天大鼠清醒后進(jìn)行隨機分組。

1.2.2 取材 術(shù)后4 w和12 w取材。引頸處死大鼠后暴露雙側(cè)坐骨神經(jīng)，并以吻合口為中心切取右側(cè)坐骨神經(jīng)約1.5 cm，同時切取左側(cè)相同區(qū)段正常神經(jīng)作為對照，分別置于10%甲醛中固定。

1.2.3 觀察指標(biāo) (1)Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組織化學(xué)染色:神經(jīng)標(biāo)本固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度4μm，采用SABC法，Ⅰ、Ⅲ型膠原單克隆抗體一抗?jié)舛染鶠?∶50，染色方法按照試劑說明書步驟進(jìn)行，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，脫水封片。(2)羥脯氨酸消化法測定膠原蛋白含量:切取坐骨神經(jīng)損傷最明顯處神經(jīng)瘢痕0.4 cm，拆去尼龍無損傷縫合線，同時切取對側(cè)同區(qū)段正常神經(jīng)0.4 cm，分別準(zhǔn)確稱取待測神經(jīng)組織的重量。稱重后放在勻漿管口部，用小剪刀剪碎，按重量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，勻漿時間10 s/min，間隙30 s，連續(xù)3～5次，在冰水中進(jìn)行。勻漿后以3 500 r/min離心10 min，取上清0.1 ml加0.4 ml生理鹽水，稀釋成2%的組織勻漿2份待測。取1份勻漿按考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒說明書配制空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管，靜置10 min，595 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管OD值。并按下面公式計算蛋白含量:

取另一份勻漿液按羥脯氨酸測試盒說明書消化步驟分別配制空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管，混勻，37℃水浴3 h，然后按說明分別向3管添加相應(yīng)試劑，混勻，60℃水浴15 min，流水冷卻后，3 500 r/min，離心10 min，取上清在550 nm處，1 cm光徑，蒸餾水凋零，測各管OD值。

按上式計算組織中羥脯氨酸量，并按公式:膠原蛋白含量=羥脯氨酸量÷13.4%，計算出組織中膠原蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，不同組間、同組在不同時相點的比較均采用成組t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ、Ⅲ型膠原的免疫組織化學(xué)觀察 鏡下可見膠原纖維被染成棕黃色。實驗組吻合口處Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維增生少，神經(jīng)纖維排列整齊，空泡變性少見。對照組Ⅰ、Ⅲ型膠原在吻合口處有明顯增生，有的甚至形成膠原團(tuán)塊，神經(jīng)纖維稀疏，組織間存在廣泛空泡變性。圖像分析表明對照組Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維在4 w、12 w兩個時相點上均比實驗組和正常神經(jīng)增生明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)量與正常神經(jīng)比較差異不明顯(P＞0.05)。見表1，圖1。

表1 神經(jīng)吻合口Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維百分比(x ±s，n=10，%)

圖1 兩組12 w時吻合口處膠原纖維(×100，縱切)

2.2 羥脯氨酸消化法測定損傷處神經(jīng)組織中膠原蛋白含量在正常神經(jīng)中膠原蛋白含量約為(3.68±0.28)μg/mgprot，實驗組12 w時膠原蛋白含量為(3.99±0.34)μg/mgprot，與正常神經(jīng)膠原蛋白含量無明顯差異(P＞0.05，t=1.87)。對照組12 w時膠原蛋白含量為(5.32±0.65)μg/mgprot，明顯高于正常神經(jīng)和實驗組12 w時膠原蛋白含量，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

3 討論

3.1 鈣通道阻滯劑抑制瘢痕的作用機制 1992年Lee等首先報道了鈣通道阻滯劑在臨床上瘢痕治療中的作用，Jamil等〔3〕將其用于治療陰莖硬化纖維病，取得良好效果，Steinleitner等〔4〕通過動物實驗發(fā)現(xiàn)鈣通道阻滯劑對腹部手術(shù)后粘連有預(yù)防作用。Diegelmann等〔6〕發(fā)現(xiàn)鈣通道阻滯劑能夠破壞細(xì)胞骨架，阻斷高爾基體來源的囊泡移動，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)原膠原增加。Lee等〔7〕發(fā)現(xiàn)維拉帕米能抑制原膠原蛋白等大分子分泌到細(xì)胞外，Michael等〔8〕進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)蓄積在細(xì)胞內(nèi)的原膠原蛋白又反饋性的抑制原膠原基因的轉(zhuǎn)錄，從而減少了膠原蛋白的生成，其效應(yīng)有濃度依賴性。至目前為止，雖然對于鈣通道阻滯劑發(fā)揮抑制瘢痕作用的機制尚存在爭議，但原膠原蛋白等大分子的分泌是鈣依賴過程已經(jīng)成為人們的共識。

3.2 鈣通道阻滯劑抑制神經(jīng)瘢痕的機制探討 鈣通道阻滯劑在治療其他組織的瘢痕和纖維化疾病的研究中已經(jīng)取得了可喜的進(jìn)展，而鈣通道阻滯劑對神經(jīng)瘢痕的形成過程有無抑制作用國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性神經(jīng)瘢痕同其他組織修復(fù)時的瘢痕在組織學(xué)上很相近，也主要是以成纖維細(xì)胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)在損傷處的異常沉積為特征。所以推測，鈣通道阻滯劑也應(yīng)該能夠抑制神經(jīng)瘢痕的形成，這正是本研究觀察的主要目標(biāo)及意義所在。本實驗采用Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化染色觀察了神經(jīng)瘢痕中兩種主要膠原纖維的分布。Ⅰ、Ⅲ型膠原的物理性質(zhì)有著很大差別，Ⅰ型膠原纖維粗大，抗張力強，主要分布在肌腱、骨骼、牙本質(zhì)等堅硬組織中;而Ⅲ型膠原纖維細(xì)小，抗張力小，主要分布在胚胎皮膚、血管、胃腸道等處。在正常神經(jīng)中，Ⅰ型膠原主要分布在神經(jīng)外膜，束膜和內(nèi)膜也有少量分布;Ⅲ型膠原在三層膜中都有分布，但主要分布在神經(jīng)束膜和內(nèi)膜〔9〕。本實驗觀察到神經(jīng)損傷后Ⅰ型膠原纖維在神經(jīng)束膜、內(nèi)膜均有明顯增生，甚至形成膠原團(tuán)塊，因為Ⅰ型膠原纖維粗大，其增生雖然增加了組織的抗張性，但對神經(jīng)組織內(nèi)的髓鞘、軸突和微血管可能造成壓迫，并使新生的神經(jīng)纖維再次脫髓鞘，組織間存在廣泛空泡變性。經(jīng)維拉帕米干預(yù)后，Ⅰ、Ⅲ型膠原在神經(jīng)束膜內(nèi)膜沉積減少，同時組織內(nèi)血管分布增多，髓鞘變性減少，說明維拉帕米可能通過抑制膠原的沉積，改善神經(jīng)再生的組織環(huán)境，間接促進(jìn)了神經(jīng)恢復(fù)。

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2 Atkins S，Smith KG，Loescher AR，et al.Scarring impedes regeneration at sites of peripheral nerve repair〔J〕.Neuroreport，2006;17(12):1245-9.

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5 熊 業(yè)，陳宗榮，程天民.維拉帕米對放燒復(fù)合傷大鼠心肌線粒體功能的保護(hù)作用〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1995;17(2):93-5.

6 Diegelmann RF，Peterkofsky B.Inhibition of collagen secretion from bone and cultured fibroblasts by microtubular disruptive drugs〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1972;69(14):892-6.

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9 陳振兵，洪光祥.鼠神經(jīng)膠原的免疫組織化學(xué)與電鏡觀察〔J〕.中華手外科雜志，1997;13(1):53-60.