岡田酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立阿爾茨海默病細(xì)胞模型超微結(jié)構(gòu)的變化

吳敏霞 許 盈 胡祥炬 林 曦

(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系電鏡室，福建 福州 350004)

過度磷酸化的tau蛋白可引起微管生成障礙，導(dǎo)致軸漿流中斷，軸索運輸失常，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞的死亡。課題組前期的研究也證明岡田酸(OA)作用于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞tau蛋白過度磷酸化，與阿爾茨海默病(AD)病人腦組織中的病理特征一致，可作為研究AD的細(xì)胞模型〔1〕。在此基礎(chǔ)上，本實驗擬從超微水平揭示AD腦中tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的微管結(jié)構(gòu)破壞與神經(jīng)元退變的因果關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞 OA，Sigma公司產(chǎn)品，用二甲基亞砜(DMSO)配成20μmol/L的母液，分裝備用。胎牛血清，杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品。1640培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。SH-SY5Y細(xì)胞，福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系贈送。CO2培養(yǎng)箱，SHEL LAB公司;倒置相差顯微鏡，Olympic公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞用含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞間隙變得較明顯，細(xì)胞突起有所回收時終止消化，RPMI1640培養(yǎng)液吹打成單個細(xì)胞懸液，3～4 d傳代一次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法 以每孔1×104細(xì)胞數(shù)接種于96孔板，96孔板內(nèi)的細(xì)胞分別每孔加入10，20，40 nmol/L蛋白磷酸酯酶(PP)-2A和-1抑制劑OA的1640培養(yǎng)液(含2.5%胎牛血清)100 μl，每種濃度4 孔，培養(yǎng)6，12，24，48，72 h。實驗結(jié)束后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)10μl，37℃，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10 min，溶解生成的深藍(lán)色結(jié)晶，選擇波長490 nm，在BIO-RAD Model 450酶標(biāo)儀測OD490 nm值，作為反映細(xì)胞代謝狀況的參數(shù)。

1.2.3 光學(xué)顯微鏡觀察 接種細(xì)胞如MTT法，然后用倒置相差顯微鏡進(jìn)行觀察、攝片。

1.2.4 超薄切片技術(shù)及電子顯微鏡觀察 取SH-SY5Y細(xì)胞1 ×106，置尖底離心管，1 000～1 500 r/min，離心8 ～10 min，去上清，沿壁小心滴加3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定數(shù)天(或數(shù)小時)(4℃)，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定1.5 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗;70%酒精飽和醋酸鈾染液塊染，酒精-丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋。超薄切片80 nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛各染色5 min;在飛利浦EM 208型透射電鏡下觀察、攝影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 計量資料采用x±s表示，采用方差分析進(jìn)行組間、組內(nèi)顯著性比較，當(dāng)差別有顯著性意義時再用Student-Newman-Keuls檢驗進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法繪制細(xì)胞生長曲線 模型組20，40 nmol/L細(xì)胞活性 OD值(0.264±0.039，0.160±0.013)較對照組(0.514±0.032)顯著減少(P＜0.05);而5，10 nmol/L細(xì)胞活性(0.493±0.022，0.478±0.021)與對照組無差異(P＞0.05)。表明20 nmol/L以上OA可致SH-SY5Y細(xì)胞活性顯著下降，且呈劑量依賴型。

2.2 光學(xué)顯微鏡觀察 20 nmol/L OA作用后細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞胞體皺縮，突起縮短消失。見圖1。

2.3 電鏡下觀察 正常組的細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞突起處微管結(jié)構(gòu)可見，OA作用于SH-SY5Y細(xì)胞后處理組細(xì)胞突起回縮，微管結(jié)構(gòu)不清晰。見圖2。

圖1 OA作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h形態(tài)改變

圖2 OA作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h微管的改變

3 討論

AD老年性癡呆主要病理特征為神經(jīng)細(xì)胞間的SP及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)。神經(jīng)元纖維纏結(jié)由雙股螺旋細(xì)絲組成，每根微絲的直徑為10 nm，每隔80 nm有個相互交叉點，形成典型的雙股螺旋狀，這種雙股螺旋細(xì)絲由大量異常磷酸化的tau蛋白組成。微管是重要的細(xì)胞骨架組成，與有絲分裂，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，細(xì)胞特性及細(xì)胞標(biāo)志等多種功能有關(guān)。在神經(jīng)細(xì)胞中，微管結(jié)構(gòu)的完整性是神經(jīng)細(xì)胞胞體與軸突間營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)幕A(chǔ)。大量的病理臨床研究也證明聯(lián)合皮質(zhì)中含神經(jīng)元纖維纏結(jié)的神經(jīng)元密度常和癡呆程度有平行關(guān)系〔2～4〕。

有關(guān)AD動物模型和細(xì)胞模型的研究一直是探索的熱點。AD細(xì)胞模型是在體外進(jìn)行誘導(dǎo)和建立，與AD動物模型相比較，具有可避免各種干擾因素，實驗條件容易控制等優(yōu)點。AD腦中tau蛋白被異常過度磷酸化，每克分子tau蛋白的磷酸含量由2～3 mol增高至5～9 mol，AD腦內(nèi)的神經(jīng)元的蛋白激酶系統(tǒng)和磷酸酯酶系統(tǒng)之間的失衡被認(rèn)為是tau蛋白過度磷酸化的原因〔5〕。Dupont等〔6〕發(fā)現(xiàn)，OA 能使 SH-SY5Y 中胎兒 tau蛋白轉(zhuǎn)變成AD樣磷酸化tau蛋白。因此本課題組前期試驗用OA作用于SH-SY5Y細(xì)胞，OA是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑，能抑制磷酸酯酶活性，使蛋白高度磷酸化，由此建立AD樣細(xì)胞模型。但是對于OA作用后細(xì)胞超微形態(tài)及微管結(jié)構(gòu)未作進(jìn)一步研究，本實驗在此基礎(chǔ)上探討AD樣細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。

本研究選用OA作用于SH-SY5Y細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型，研究結(jié)果顯示，隨著OA作用時間的延長和濃度的逐漸增高，細(xì)胞活性逐漸下降，SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變較為顯著，出現(xiàn)類似于凋亡的固縮反應(yīng)。在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)紊亂，突起回縮明顯，可認(rèn)為是OA作用后微管相關(guān)蛋白tau的過度磷酸化使得微管組裝降低，微管解聚，這與文獻(xiàn)上報道是一致的〔7〕，提示采用本研究方法建立AD模型是可行的。OA可使SH-SY5Y細(xì)胞活性降低，微管結(jié)構(gòu)破壞，可作為研究AD的細(xì)胞模型。

1 許文芳，吳敏霞，謝捷明.岡田酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白的過度磷酸化〔J〕.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006;40(4):361-3.

2 Cummings JL，Vinters HV，Cole GM，et al.Alzheimer's disease:etiologies pathophysiology，cognitive reserve，and treatment opportunities〔J〕.Neurology，1998;51(1-1):2-17.

3 朱粹青，曹小定.調(diào)心方藥物血清對動物阿爾茨海默病相關(guān)的tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001;21(11):834-6.

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