γ-分泌酶組件NCT在癡呆小鼠中樞神經系統的分布及表達

龍志敏 趙 蕾 賀桂瓊 宋 沖 楚亞楠

(重慶醫科大學神經科學研究中心，重慶 400016)

β淀粉樣蛋白(beta-Amyloid protein，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques，SP)是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的典型病理特征之一。Aβ來源于腦內β-分泌酶和γ-分泌酶對淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)跨膜區的切割。Aβ主要有兩種形式:Aβ40和Aβ42(二者比例為9∶1)，其中Aβ42容易纖維化聚集形成具有毒性的低聚體，Aβ42產生過多極易導致SP的形成以及AD的發生。由于γ-分泌酶是催化Aβ生成的終末階段，且是決定Aβ40/Aβ42比例的關鍵酶，因此該酶目前已成為AD的潛在性治療靶點〔1〕?，F已證實γ-分泌酶是由早老素(Presenilin，PS)、前咽缺陷蛋白(Aph-1)、早老蛋白增強子2(Pen2)和單過性跨膜蛋白(Nicastrin，NCT)四種蛋白亞基構成的一種多蛋白復合體〔2〕，其中PS是γ-分泌酶的活性中心〔3〕，但PS活性受γ-分泌酶其他組分的調控，其中最為密切的是NCT〔4〕。本文以不同發育階段的APP/PS1雙重轉基因AD模型小鼠和同窩野生型小鼠為研究對象，采用形態學方法系統研究NCT在中樞神經系統(CNS)的分布與表達，以期進一步明確NCT的功能及與AD的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 APP/PS1雙重轉基因傳代小鼠的建立 將購于Jackson Lab雄性和雌性的APP/PS1雙轉基因雜合體種鼠B6C3-Tg(APPswe，PSEN1de9)85Dbo/J合籠，交配繁殖。產下的后代用PCR進行基因分型。

1.1.2 試劑 兔抗NCT多克隆抗體(Convance公司);鼠抗PS單克隆抗體(abcam公司);小鼠抗Aβ單克隆抗體:靶向Aβ1～17的6E10，靶向Aβ17～24的4G8(Sigma公司);鼠抗 β-actin 單克隆抗體(Santa Cruz公司);羊抗兔和羊抗小鼠IgG二抗(Jackson Immunoreseach Laboratories，USA);DNA提取試劑盒(Tiangen公司);鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復合體(SABC)免疫組化試劑盒(北京中杉);二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(Pierce，USA);其他均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 對APP/PS1雙重轉基因小鼠進行鑒定。剪子代小鼠鼠尾約0.5 cm，按照試劑盒(Tiangen公司)步驟提取基因組DNA，核酸蛋白測定儀測定濃度后進行PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外分析儀下觀察同時出現APP、PS1條帶的即為APP/PS1雙轉基因小鼠。PCR擴增:根據提供的引物擴增APP和PS1，以β-actin為內對照。APP引物上游:5'-CACCACAGAATCCAAGTCGG-3'，下游:5'-CTTGACGTTCTGGCCTCTTCC-3';PS1引物上游:5'-CAGGTGCTATAAGGTCAT-3'，下游:5'-ATCACAGCCAAGATGAGC-3';β-actin 引物上游:5'-GACAGGATGCAGAAGGAGAT-3'，下 游:5'-TTGCTGATCCACATCTGCTG-3'。PCR 反應條件:94℃ ×5 min→(94℃ 30 s→58℃ 40 s→72℃ 40 s)共35個循環→72℃ 10 min(－20℃保存PCR產物)。APP基因PCR產物長350 bp，PS1擴增片段長608 bp，β-actin 為446 bp。

1.2.2 動物分組及處理 根據基因分型結果，APP/PS1基因陽性小鼠為AD模型組，同窩野生型小鼠為對照組。設置5個觀察時間點，分別為出生后 1 d、7 d、21 d、90 d和 180 d，記為P1、P7、P21、P90、P180。

1.2.3 免疫組織化學染色 小鼠腹腔注射2%水合氯醛麻醉成功后開胸，經心臟灌注4%多聚甲醛固定后，取腦入多聚甲醛后固定8 h，常規脫水透明石蠟包埋，然后分別進行冠狀和矢狀切片，厚度4μm。切片經二甲苯脫蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，微波煮沸抗原修復，自然冷卻，再經3%H2O2處理15 min以封閉內源性過氧化物酶活性，5%胎牛血清(BSA)封閉1 h后，加入Ⅰ抗，4℃過夜。Ⅱ抗和SP復合物于室溫孵育2 h。最后用DAB顯色。常規脫水、透明、封片，光鏡下觀察。

1.2.4 免疫熒光雙標 切片脫蠟后，經PBS沖洗3次，然后放入含0.3%TritonX-100的PBS中，室溫浸泡30 min，再用PBS沖洗3次，5%正常山羊血清室溫封閉1 h，然后加入Ⅰ抗:兔抗NCT抗體 (1∶200)及小鼠抗 PS1單克隆抗體(1∶1 000);或兔抗NCT抗體 (1∶200)及小鼠抗Aβ抗體6E10(1∶50)，孵育24 h(4℃)，PBS沖洗3次;加入Ⅱ抗:山羊抗兔 FITC(1∶400)和山羊抗小鼠TRITC(1∶400)，室溫孵育2～4 h;PBS沖洗;甘油封片。激光共聚焦熒光顯微鏡(Carl Zeiss MicroImaging，Inc.)觀察并采圖。陰性對照:免疫組化和免疫熒光染色時，用正常山羊血清代替I抗孵育APP/PS1轉基因小鼠和野生型小鼠腦切片，經上述免疫組織化學和免疫熒光染色，未見明顯的特異性免疫陽性反應產物。

2 結果

2.1 APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠的鑒定結果 雌性和雄性種鼠產下后代，剪鼠尾提取基因組DNA經PCR擴增后，1.5%瓊脂糖電泳結果:同時出現 APP條帶(350 bp)和 PS1條帶(608 bp)的即為APP/PS1雙轉基因陽性小鼠。見圖1。

2.2 NCT在成年APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠CNS各區域的分布 取出生后180 d的APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠腦和脊髓進行免疫組化，結果顯示:NCT陽性細胞廣泛分布于成年癡呆小鼠CNS各區域，包括大腦新皮質、嗅腦、海馬、丘腦、紋狀體、小腦、腦干和脊髓等，其中NCT陽性反應主要出現在神經元，而未出現在膠質細胞內。癡呆小鼠大腦新皮質的NCT陽性細胞主要分布于第Ⅳ、V層，而表層(I層)出現的NCT陽性細胞少;嗅腦內的NCT陽性細胞主要分布于內皮層的第Ⅱ層;海馬內的NCT陽性細胞主要出現在錐體細胞和顆粒細胞層;中腦黑質區域出現NCT強陽性反應;隔區有中等強度的NCT陽性反應;紋狀體和丘腦內僅呈弱陽性表達;小腦內的NCT陽性反應以Purkinje細胞層表達較多，顆粒細胞層表達較弱;腦橋和延髓內的神經核團(尤其是運動核)內NCT表達非常明顯;第三、四腦室及側腦室脈絡叢出現NCT強陽性表達;在脊髓灰質前角、后角和側角及灰白質交界的網狀結構內NCT呈強陽性表達，而白質區域幾乎未見NCT陽性細胞。見圖2。

圖1 APP/PS1雙轉基因小鼠的基因分型電泳圖

2.3 NCT的分布與SP及Aβ分布的關系 免疫組化結果顯示，出生后180 d的成年癡呆小鼠CNS內出現大量SP，其大小和形態不一，但染色較均勻。其中癡呆小鼠大腦新皮質和海馬內SP體積大、數量多、密集分布;腦室脈絡叢內可見較多的陽性斑塊;小腦皮質內可見少量散在的SP分布;但腦干和脊髓內未見SP。見圖3。為弄清細胞內NCT與Aβ是否共存，實驗中取成年癡呆小鼠的腦組織進行了免疫熒光雙標。結果顯示:癡呆小鼠腦部各區均出現大量NCT陽性細胞(綠色熒光)和Aβ陽性細胞(紅色熒光)，但在大腦皮質和海馬內NCT陽性神經元的數量要多于Aβ陽性細胞，且在一些神經元內NCT與Aβ出現了共存。見圖4。

2.4 NCT與PS1在成年癡呆小鼠腦組織中的共存 免疫熒光雙標結果顯示:PS1在成年APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠腦組織的分布趨勢同NCT的分布高度一致。不同的是，在神經元內PS1免疫陽性物在胞漿中表達較強，而NCT免疫陽性物在胞漿、胞膜均有強表達。見圖5。

圖2 NCT在APP/PS1雙轉基因小鼠CNS各區域的分布

圖3 SP在APP/PS1雙轉基因小鼠CNS各區域的分布(×100)

圖4 免疫熒光雙標顯示

圖5 免疫熒光雙標顯示

2.5 NCT在不同發育階段癡呆小鼠及同窩野生型小鼠腦內的動態分布情況 出生后1 d(P1)的癡呆小鼠和同窩野生型小鼠大腦皮質內NCT陽性神經元排列致密，免疫陽性物質主要分布于神經元胞體，包括細胞膜、細胞質、核膜和突觸;隨著小鼠的發育，腦組織單位面積內NCT陽性神經元數量逐漸減少，一部分NCT逐漸被運輸到神經元的樹突和神經纖維網中，NCT免疫陽性物質主要分布于細胞膜、部分細胞質和突起，細胞膜染色較深，細胞質染色較淺。與各年齡段野生型小鼠相比，癡呆小鼠腦內NCT陽性神經元的染色深度明顯高于野生型小鼠且癡呆小鼠腦內NCT免疫陽性物質在整個胞質和突觸的分布更明顯。見圖6。

圖6 NCT在不同年齡段APP/PS1雙轉基因及同窩野生型小鼠腦中分布及表達的比較(×400)

3 討論

NCT是2000年YU〔5〕等在純化PS片段時分離出的一種與γ-分泌酶功能和 Aβ產生有關的重要蛋白質。近期研究發現〔6～8〕，NCT 缺乏會使 γ-分泌酶活性下降、Aβ 產生減少;過度表達的NCT可增加Aβ的生成;NCT胞外功能區DYIGS基序的人工缺失及人工誘導的突變產物會使Aβ尤其是Aβ42明顯增多。以上研究提示，NCT的結構變異或表達水平的改變將導致Aβ生成量的異常，可能與AD的發生發展密切相關。AD可分為家族性(FAD)和散發性(SAD)兩種，FAD主要是常染色體顯性遺傳病，僅占全部AD的10%以下，目前已證實APP和PS的突變是引起FAD的主要原因;其余絕大多數AD屬散發性，由多因素引起。本實驗采用的是APPswe/PS△E9雙轉基因小鼠模型，APPswe是“瑞典家族”突變，突變發生在APP編碼序列末端，670、671位點，Lvs與 Met分別被 Asn與 Leu取代;PS△E9是在FAD中發現的第9外顯子缺失突變。攜帶APPswe和PS1突變基因的小鼠具有AD患者的特征性改變，包括空間學習和記憶障礙、SP沉積、神經元丟失及反應性膠質細胞增生，被認為是理想的AD動物模型。

目前關于AD的發病機制形成了幾種學說，其中較為公認的是“Aβ學說”，該學說認為Aβ產生過多并沉積是引起AD的中心環節。Aβ是由APP經β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶相繼作用后產生。據文獻報道〔9～11〕，無論是AD患者還是轉基因AD模型鼠腦內均出現了BACE1蛋白水平增多、β-分泌酶活性增強，但是否出現γ-分泌酶表達及活性的改變尚未見文獻報道。γ-分泌酶是唯一負責I型跨膜蛋白(如APP、Notch、E-cadherin、ErbB-4等)延伸序列的細胞膜內分裂的膜連蛋白。在γ-分泌酶復合體的四個組件蛋白，第一個被發現且研究得最透徹的是PS。目前已證實PS1水解生成的PS1 CTF/NTF異二聚體是γ-分泌酶的催化活性中心，PS1的異常突變是引起家族性AD的主要原因。γ-分泌酶中第二個被發現且與PS1關系最密切的蛋白亞基是NCT，有證據顯示，NCT上有γ-分泌酶的底物結合位點〔12〕，參與 γ-分泌酶與底物的選擇性結合;最近研究還發現，NCT的胞外功能區可識別和結合γ-分泌酶的底物，被稱為γ-分泌酶的底物受體〔13〕。作為γ-分泌酶結合位點兼底物受體的NCT，其表達水平變化勢必影響底物(如sAPP)進入γ-分泌酶的數量，進而影響產物(如Aβ)的產量?？梢灶A見，通過有選擇性的調節NCT的表達水平來調控γ-分泌酶活性及Aβ的生成量，有望緩解AD癥狀，達到治療AD的目的。盡管目前國際上對NCT的研究在分子水平取得了不少進展，但關于NCT在AD患者CNS中的分布及表達、NCT的分布與SP及Aβ分布的關系、NCT在AD患者及正常人腦組織中的分布和表達的差異等形態學方面的研究卻鮮有報道。

NCT主要由成纖維細胞和神經元合成，在體內廣泛分布。Hebert等〔14〕發現小鼠不同組織中 NCT mRNA的表達水平不同。NCT在小鼠肝臟、心臟、腎臟和睪丸中表達最高，骨骼肌表達最少，在腦中表達水平一般，但NCT在CNS各區域分布的情況如何尚無可知。本實驗取出生后6個月的成年APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠的腦和脊髓進行免疫組化染色，結果發現，NCT廣泛分布于癡呆小鼠腦和脊髓的各個區域，但不是均勻分布，其中NCT陽性神經元在大腦新皮質的第Ⅳ～V層、內嗅皮質第Ⅱ層和海馬的錐體細胞和顆粒細胞層的分布最密集;其次在中腦黑質區域、隔區、紋狀體、丘腦、小腦皮質Purkinje細胞層、腦橋和延髓內的神經核團(尤其是運動核)、各腦室脈絡叢及脊髓灰質等有較多分布，這一結果與Kodama等〔15〕觀察到的NCT在正常小鼠CNS各區域分布的結果相似。

與NCT在CNS各區域的分布相比，神經元外的SP在出生后6個月的成年癡呆小鼠CNS中的分布極為局限，主要選擇性分布于大腦新皮質、內嗅區及海馬等與學習記憶密切相關的區域，在側腦室脈絡叢及小腦皮質有極少量的分布，而腦干及脊髓內未見SP。既然NCT的分布比細胞外Aβ沉積的范圍廣，那么，在大腦皮質與海馬區域，NCT是否與神經元內的Aβ共存?實驗中通過免疫熒光雙標發現，在大腦皮質和海馬，NCT陽性神經元的數量仍較Aβ陽性神經元的數量多，幾乎所有Aβ陽性神經元能與NCT陽性神經元疊加，即神經元內的Aβ與NCT出現了共存，但有一部分NCT陽性神經元內并未出現Aβ，提示這部分NCT可能未參與Aβ的生成，即NCT除與Aβ的生成、AD的發生有關外，尚存在其他功能。在γ-分泌酶“四人家庭成員”中，NCT和PS1的關系尤為密切。已有不少研究以正常大鼠或細胞為研究對象，用分子生物學方法觀察到NCT與PS1之間形成了NCT-PS1復合物，且NCT的成熟依賴于PS1〔3〕，那么，在癡呆小鼠腦內，NCT與PS1在分布上有怎樣的關聯呢?本實驗發現PS1在癡呆小鼠腦中的分布趨勢同NCT的分布高度一致，只是在神經元內的分布，PS偏重在胞質表達，而NCT在胞質、胞膜均有表達，且二者在神經元內共存。

為弄清NCT在癡呆小鼠與正常小鼠腦組織中的分布及表達是否存在差異，實驗中取不同發育階段的APP/PS1雙重轉基因癡呆小鼠及同窩野生型小鼠的腦組織進行了免疫組化，結果發現，無論是癡呆型還是野生型，新生小鼠腦內的NCT陽性神經元在大腦皮質的分布密集;隨著小鼠的發育，單位面積內NCT陽性神經元數量逐漸減少。不同的是，無論在哪一個年齡段，癡呆小鼠腦神經元內的NCT免疫陽性物不僅見于細胞膜和突起，更顯著的是較多的NCT還分布于整個胞質，即細胞膜和細胞質均濃染;而同窩野生型小鼠腦神經元內的NCT主要分布于細胞膜周圍，故細胞膜周圍染色較深，而胞質染色極淺甚至不著色。該現象提示，NCT在癡呆小鼠和正常小鼠腦神經元內的分布及表達存在差異，那么，這種差異是否與癡呆小鼠腦組織中Aβ的生成有關呢?已有研究表明，NCT最初在內質網中合成，然后向高爾基復合體及細胞膜等轉運。正常情況下，絕大多數NCT分布于高爾基體外側網絡(Trans-Golgi Network，TGN)，即靠近細胞膜分布;少量分布于內質網、溶酶體、線粒體等位于胞漿內或靠近核膜的細胞器〔16〕。近期研究發現〔7〕，NCT在亞細胞水平的分布會影響不同形式Aβ的產生:細胞膜富含NCT的細胞主要產生分泌型Aβ，其中以Aβ40為主;而若細胞的線粒體、TGN和溶酶體所含的NCT突變或表達水平增加，則導致細胞內Aβ的產生以Aβ42為主，成為形成SP的罪魁禍首。根據本實驗的結果，結合相關的文獻報道，推測NCT在癡呆小鼠和正常小鼠腦神經元內分布及表達的差異與Aβ的生成及AD的發生密切相關。但NCT在兩種小鼠腦內的分布及表達為什么會出現這種差異，是由于NCT在合成過程中出現了錯誤折疊、轉運障礙還是NCT的蛋白降解出現了障礙?關于這些問題有待進一步探討。

綜上，本實驗通過形態學方法發現，NCT在成年癡呆小鼠CNS各區域廣泛分布，但在大腦皮質和海馬內的分布最密集;NCT的分布范圍要遠遠比Aβ沉積的范圍廣;在不同發育階段的癡呆小鼠和同窩野生型小鼠腦內，NCT的表達和分布出現了差異，這種差異可能與Aβ的生成及AD的發生有關。

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