托吡酯對(duì)海人酸致癇大鼠海馬組織 P-糖蛋白和核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

王海燕,張英琦,遲瑛嬌,聶 磊,王麗敏

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)二科,黑龍江 佳木斯 154003)

目前 ,難治性癲癇(intractable epilepsy,IE,RE)發(fā)病機(jī)理不十分清楚,其中研究最多的是多藥耐藥基因1(multidrug-resistance 1,mdrl)及其編碼的能量依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)通過(guò)改變藥物運(yùn)輸對(duì) MDR形成的影響[1]。近年來(lái)隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)多藥耐藥的發(fā)生也與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組有關(guān),NF-κB(nuclear factor of kappa B)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組方面起著關(guān)鍵作用[2～4]。但有關(guān) RE腦組織 NF-κ B水平變化及其托吡酯(TPM)對(duì)其表達(dá)的影響國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠海人酸(Kainic acid,KA)致癇模型,應(yīng)用免疫組化方法測(cè)定海馬 P-gp和 N F-κ B的表達(dá)及TPM對(duì)其表達(dá)的影響 ,以探討 P-gp和 NF-κ B是否參與RE的耐藥機(jī)制,從而使 N F-κ B有可能成為 RE治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康的 Wistar大鼠 84只,體重 200～ 250g雌雄不拘,由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。KA購(gòu)自美國(guó) Sigma公司;P-gp、NF-κ B免疫組化試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組:將84只大鼠隨機(jī)分為3組:生理鹽水對(duì)照組24只;KA組30只;TPM治療組30只,在應(yīng)用 KA前每天給TPM治療組大鼠灌胃一次,至第14d灌胃后2h注射 KA。每組再分為 6h、24h、3d3個(gè)時(shí)間組。

1.2.2 動(dòng)物模型制作及大鼠驚厥分級(jí):將大鼠麻醉后固定于腦立體定向儀上,頭顱正中切口,暴露前囟,將進(jìn)樣器針尖抵住前囟位置讀出 X,Y,Z的原始值視為原點(diǎn),依大鼠立體定向圖譜,所確定的目標(biāo)即右側(cè)海馬 CA3區(qū):X-4.5mm,Y+4.5mm,Z硬膜下4mm,調(diào)整 XY坐標(biāo),顯露硬膜,在調(diào)整 Z值至硬膜下4mm。通過(guò)微量進(jìn)樣器半分鐘內(nèi)緩慢注入KA1 μL,留針3～ 5min。癲癇發(fā)作分級(jí)參考 Racine[5]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)。

1.2.3 標(biāo)本的制作:分別于 KA注藥后 6h、24h、3d時(shí)間點(diǎn),予 4%多聚甲醛溶液灌注取腦 (雙側(cè)海馬),放入4%多聚甲醛溶液中保存待測(cè)。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,連續(xù)切片備用。

1.2.4 免疫組化染色:采用免疫組織化學(xué)方法(ABC),防脫處理;常規(guī)脫蠟;滅活內(nèi)源性酶;修復(fù)抗原;滴加正常山羊血清封閉液室溫20min。按步驟先后滴加適當(dāng)稀釋的Ⅰ抗(兔抗鼠 Pgp,N F-ΚB)和生物素Ⅱ抗;DAB顯色,充分水洗;蘇木素復(fù)染;乙醇梯度脫水、透明;中性樹(shù)膠封片觀察。P-gp陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色,N F-κB免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核染成棕黃色或有棕黃色沉積。每張切片在200倍顯微鏡下觀察海馬陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)求其平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū) P-gp表達(dá)結(jié)果

以膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為 P-gp陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。KA組 P-gp的表達(dá)較對(duì)照組明顯增高 (P＜0.01),P-gp的表達(dá)在 KA注射6h后升高 (P ＜0.01),24h時(shí)達(dá)高峰 (P＜0.01),3d時(shí)下降但仍然高于6h組 (P＜0.01);TPM組 P-gp的表達(dá)與 KA組各時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)顯著差異(P ＞ 0.05)。(見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬 P-gp陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 ±s)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬 P-gp陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 ±s)

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.01;與 K A組比較,#P＞ 0.05。

組別 6h 24h 3d對(duì)照組 2.10± 0.742.06± 0.612.08± 0.78 KA組 3.66± 0.62* 18.66± 2.84* 11.21± 1.75*T PM組 4.01± 0.36*# 19.06±2.06*# 11.96± 2.62*#F值 25.69117.6268.55 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 各組大鼠海馬區(qū) NF-κB表達(dá)結(jié)果

KA組 N F-κ B的表達(dá)比對(duì)照組明顯增高 (P ＜0.01),N F-κ B的表達(dá)在 KA注射 6h后升高,24h時(shí)達(dá)高峰(P ＜0.01),3d時(shí)仍維持較高水平;TPM組 N F-κB的表達(dá)與 KA組各時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)顯著差異 (P＞ 0.05)。(見(jiàn)表2)。

表2 不同處理組在不同時(shí)間海馬 N F-κ B陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞個(gè)數(shù)比較 ±s)

表2 不同處理組在不同時(shí)間海馬 N F-κ B陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞個(gè)數(shù)比較 ±s)

注:與對(duì)照組比較,*P ＜0.01;與 K A組比較,#P＞ 0.05。

組別 6h 24h 3d對(duì)照組 1.87± 0.291.70± 0.111.81±0.30 KA組 4.73± 0.68* 24.28± 2.09* 24.16± 2.56*T PM組 4.50± 0.86*# 23.96± 3.92*# 22.617± 2.58*#F值 57.77200.55278.23 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 N F-κ B與 P-gp蛋白在 KA模型海馬組織中表達(dá)的關(guān)系

在 KA模型海馬組織中 N F-κ B與 P-gp的表達(dá)呈正相關(guān) (r= 0.86,P ＜ 0.01)。

3 討論

眾所周知,RE對(duì)抗癲癇藥物治療不敏感,主要 MDR1有關(guān)。MDR1編碼 P-gp表達(dá),P-gp實(shí)際上是 AT P依賴性藥物排出泵,能將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出,降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,減輕細(xì)胞毒作用,從而產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象,P-gp的過(guò)度表達(dá)是引起難治性癲癇多藥耐藥的主要原因。Seegers等[6]在大鼠顳葉癲癇的海人酸(KA)模型中檢測(cè) P-gp在海馬以及其他腦區(qū)表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。在癲癇狀態(tài)后24h,齒狀回的內(nèi)皮細(xì)胞和海馬的 CAl和 CA3區(qū)的實(shí)質(zhì)細(xì)胞可見(jiàn) P-gp的表達(dá)明顯升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:KA模型組 P-gp的表達(dá)明顯升高,這與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果基本一致。Crespel[7]利用合并海馬硬化的顳葉癲癇患者術(shù)后病理切片進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)細(xì)胞和大腦錐體細(xì)胞 N F-κ BP65過(guò)度表達(dá) ,并推測(cè)癲癇形成過(guò)程是由 NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過(guò)程,其過(guò)程是一個(gè)被癇樣發(fā)作反復(fù)、短暫激活的慢性過(guò)程。Matsuoka等[8]利用大鼠海人藻酸點(diǎn)燃模型發(fā)現(xiàn)癇性發(fā)作后4～ 16h內(nèi)海馬神經(jīng)元N F-κB活化明顯增加,并伴膠質(zhì)細(xì)胞 NF-κB持續(xù)活化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:KA模型組海馬 N F-κB表達(dá)顯著升高,這與國(guó)外大鼠癲癇發(fā)作使海馬神經(jīng)元 NF-κ B活化明顯增加的研究結(jié)果相符合。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)在海人酸(Kainate)大鼠模型腦組織中檢測(cè) NF-кB和 P-gp蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)了 N F-кB和 P-gp的表達(dá)呈正相關(guān)。綜上分析,N F-κ B參與 RE多藥耐藥可能的機(jī)制:一方面 N F-κ B是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控著多種基因的表達(dá),而 N F-кB和 P-gp的表達(dá)密切正相關(guān)則提示 MDR1有可能是 N F-к B下游基因之一,在 N F-к B的調(diào)節(jié)激活轉(zhuǎn)錄下 ,過(guò)度表達(dá) P-gp蛋白而引起RE多藥耐藥。事實(shí)上,Bentires-Alj等[9]證實(shí)了 MDR1啟動(dòng)子區(qū)域的第一外顯子包含一個(gè)純化的 N F-к B結(jié)合序列 (‘5-CCTT TCGGGG-3’),而 NF-кB也的確能夠激活連接MDR1啟動(dòng)子的基因轉(zhuǎn)錄。另一方面,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組可導(dǎo)致RE多藥耐藥的形成,因此與神經(jīng)元的可塑性有關(guān)的因子在RE多藥耐藥形成中起著一定的作用。以往研究發(fā)現(xiàn) AEDs中的卡馬西平、苯妥英鈉、苯巴比妥使 P-gp的表達(dá)上調(diào);而拉莫三嗪、托吡酯則不上調(diào) P—gp的表達(dá)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn) TPM組與 KA組比較僅有上升的趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與王等人研究的結(jié)果是一致的。推測(cè) KA致癲癇大鼠海馬組織 P-gp的過(guò)度表達(dá)是癲癇發(fā)作的結(jié)果,與TPM無(wú)關(guān),即 T PM不上調(diào) P-gp的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中,TPM組 N F-κ BP65蛋白表達(dá)與 KA組相比,無(wú)顯著差異,提示TPM抗癲癇的作用過(guò)程可能與 NF-κ B無(wú)直接相關(guān),或者存在其他復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制參與這些抗癲癇藥的作用過(guò)程。關(guān)于 TPM作用機(jī)制與 N F-κB的關(guān)系研究目前少有報(bào)道,NF-κ B在 KA點(diǎn)燃癲癇模型中海馬組織的表達(dá)變化規(guī)律以及與癲癇腦損傷和腦保護(hù)的關(guān)系值得進(jìn)一步深入探討。

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