Livin及 NF-kbp65在非小細胞肺癌中的表達及意義

閻紅娥,姜文玉,鮑文華,王春玲

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院呼吸科,黑龍江 佳木斯 154003)

惡性腫瘤的發(fā)生不僅與腫瘤細胞的異常增殖及分化有關,而且與細胞凋亡調(diào)節(jié)紊亂所導致的細胞凋亡受抑制也有關,凋亡通路的紊亂、凋亡因子的抑制、凋亡因子的過表達以及凋亡基因的表達失控都會導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。成為惡性腫瘤形成的重要機制之一。Livin是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族成員之一,特異性表達于人的胚胎組織及大多數(shù)惡性腫瘤細胞,如黑色素瘤、白血病、前列腺癌及膀胱癌等,其在正常成人組織中低或無表達,提示該基因在腫瘤細胞的增殖和凋亡過程起著重要作用[1～4]。核因子 - κB(nuclear factor kappa B,N F- κ B)是1986年 Sen等[5]首先從成熟 B淋巴細胞核抽取物中檢出的,可與免疫球蛋白 k鏈基因的增強子序列特異性結(jié)合并促使 k鏈基因轉(zhuǎn)錄的核蛋白因子,其廣泛存在于真核細胞,是一種具有多向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子,主要通過啟動和調(diào)節(jié)多種腫瘤相關基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡及轉(zhuǎn)移,目前的研究認為它與炎癥、免疫反應、創(chuàng)傷、細胞增殖、細胞凋亡以及胚胎發(fā)育等重要事件有著密切聯(lián)系。N F-κ Bp65是它的活性成分,調(diào)控一系列基因的表達。本文旨在運用免疫組化方法測定非小細胞肺癌(NSCLC)組織中 Livin、NF-κBp65的表達及在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相互之間的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源

隨機選取佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 2009— 02～ 2011—02手術切除 NSCLC組織標本40例,其中鱗癌 30例,腺癌10例;高、中分化29例,低分化11例;按 UICC1997肺癌分期標準分期 ,Ⅰ 、Ⅱ 期 27例 ,Ⅲ 期 13例 ;男 25例 ,女 15例;有淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移的21例 ,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的19例;均為原發(fā)性肺癌,且術前未接受放化療,取10例癌旁正常肺組織作為對照。

1.2 試劑

Livin多克隆抗體(bs-0738R)、N F-κBp65兔抗人單克隆抗體(bs-0465R)均購自北京博奧森生物技術有限公司,SP免疫組織化試劑盒(KIT-9710)和 DAB顯色試劑盒(DAB-0031)均購自福州邁新生物技術公司。

1.3 實驗方法

肺癌標本經(jīng)福爾馬林液固定、常規(guī)石蠟包埋。每例連續(xù)切片 3張 ,切片厚 4 μm,供常規(guī) HE染色和 Livin、NF-κBp65免疫組織化學染色。Livin多克隆抗體濃度為1：500,N F-κBp65兔抗人多克隆抗體濃度為1：500。參照檢測試劑盒說明進行。

1.4 結(jié)果判斷標準

兩種蛋白染色陽性均為棕黃色,均表達于細胞漿。在10× 40高倍視野下,隨機選 10個視野 ,計數(shù)腫瘤細胞中陽性比例計算百分率,陽性細胞 ＜10%記為(-);陽性細胞數(shù)在10%～ 25%記為 (+);陽性細胞數(shù)在 25%～50%記為(++);陽性細胞數(shù)＞ 50%記為(+++)。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用 SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理。采用i2檢驗和 Spearman等級相關分析,P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中 Livin、NF- κ Bp65的表達

在 40例 N SCLC組織中,31例癌細胞 Livin呈陽性 [(+ )～ (+++)]表達,陽性率為77.5%;26例癌細胞 NF-kBp65呈陽性 [(+)～ (+++ )]表達,陽性率為65%。15例癌旁正常肺組織 Livin、NF-κ Bp65陽性率分別為 16.7%、26.5%。Livin和 NF-κBp65陽性均表達于癌細胞胞漿中,為棕黃色,間質(zhì)和血管均未見表達 (見圖1～ 4)。

圖4 N F- κ Bp65在肺腺癌細胞中表達(SP×200)

2.2 肺癌組織中 livin、NF-kBp65的表達與臨床病理因素的關系

Livin的表達水平與肺癌的病理類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P ＜0.05)相關,與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、分化程度無明顯相關性 (P＞ 0.05)。NF-κBp65的表達水平與肺癌分化程度、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(P ＜0.05),與患者的性別、年齡、病理類型、腫瘤直徑無明顯相關性 (P＞ 0.05),見表1。

表1 肺癌組織中 Livin、N F- κ Bp65的表達與臨床病理因素的關系

3 討論

Livin是2000年 Lin等[1]根據(jù) IAPs基因同源序列,在人的胎腎 cDN A文庫中發(fā)現(xiàn)的新成員,當時將其命名為 KIAP(Kidney inhibitor of apoptosis protein);2001年 Kasof等[2]將之命名為 Livin并沿用至今。Livin位于染色體 20q13,全長46kb,Livin蛋白 N端僅包含一個桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復序列 BIR結(jié)構,C端含一個 R ING環(huán)指結(jié)構,由于剪接方式不同分為兩種亞型,Livin a及 Livinβ。其表達分布又有不同,β亞型表達主要存在于胎兒腎臟組織中,而α亞型在其中尚未發(fā)現(xiàn)表達。在正常成人的大腦、骨骼肌、外周血淋巴細胞中可發(fā)現(xiàn)α亞型的表達,但表達水平較低。

本研究顯示,Livin蛋白在 NSCLC組織中的陽性表達率明顯高于癌旁肺組織,提示 Livin在肺癌發(fā)生中起一定作用;腺癌高于鱗癌、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,與陳曉等[6]的報道一致,提示 Livin可能在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起作用;Livin表達與肺癌 TNM分期無關,與陳曉等[6]的報道不同,可能與該實驗樣本較少及標本選擇有關,有待于以后大樣本中繼續(xù)研究。本實驗表明 Livin與肺癌組織學類型、浸潤及轉(zhuǎn)移相關,與瘤體大小、患者年齡、TNM分期無明顯相關性,可能成為肺癌檢測及治療的新靶點。

N F-κ B是一種核轉(zhuǎn)錄因子,通常和抑制蛋白 IKB組成無活性的 N F-κ B/IKB三聚體形式,在一些因素刺激下 IKB發(fā)生磷酸化后降解[7],從而使 N F-κ B被激活,當細胞受生長因子、白介素1(IL-1)、致癌物等的刺激時,IKB泛素化繼而被蛋白酶水解,活化的 P65進入細胞核,與κB結(jié)合位點結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果顯示,在正常肺組織中 ,NF-κBp65陽性表達率明顯弱于腫瘤組織,說明在非腫瘤組織中 N F-κBp65處于不斷的激活和失活的有序調(diào)控中,而在腫瘤組織中 N F-κ Bp65失去控制而被過度激活,從而導致細胞過度增殖,進而引起腫瘤的發(fā)生。本實驗結(jié)果顯示 NF-κ Bp65在低分化 NSCLC組織中的陽性表達率明顯高于中、高分化肺癌組織,提示 N F-κBp65的高表達與 NSCLC的惡性程度密切相關。有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 N F-κBp65表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,也提示了 N F-κBp65過度活化與 N SCLC的侵襲、轉(zhuǎn)移相關,N F-κBp65高表達促進了 N SCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明,NF-κ Bp65表達與病人性別、年齡、組織學類型無明顯相關性,而與瘤體大小分、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。

Livin是目前唯一一個證實能夠直接與 Caspase-3結(jié)合的蛋白,通過 BIR結(jié)構域直接抑制 Caspase-3發(fā)揮抗凋亡的作用。Kasof等[1]研究認為 Livin通過 BIR結(jié)構域可與介導細胞凋亡的下游的效應 Caspase(Caspase-3和 Caspase-7)結(jié)合,抑制其活性。最近有學者[8]發(fā)現(xiàn) livin主要通過 caspase活性參與腫瘤壞死因子(TN F)介導的信號傳導誘導核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κ B的激活從而發(fā)揮抗凋亡效應。同時一些研究表明,NF-κ B也具有抗凋亡的作用,其抗凋亡作用可能通過上調(diào)編碼抗凋亡的因子。因此二者之間存在某種相關性,共同促進腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。本試驗通過對非小細胞肺癌組織中 livin與 NF-κ Bp65的表達進行檢測分析 ,證實 Livin在NSCLC組織中陽性率為77.5%,livin高表達與肺癌分化程度相關 (P＜0.05),同時 NF-κBp65在 NSCLC組織中陽性率為65%,NF-κBp65的高表達與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P＜0.05),Livin和 N F-κ Bp65表達具呈顯著正相關(r= 0.265,P ＜0.05)。綜上所述 ,我們的研究提示 N F-κBp65可能通過上調(diào) Livin的表達,抑制細胞凋亡 ,從而增加腫瘤細胞的增殖,成為其促進肺癌發(fā)生發(fā)展的可能途徑之一。

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