益生菌對大鼠潰瘍性結腸炎作用的實驗研究

薛 宇,顏 玉,蒲 田,張高揚,喬 坤,王美巍

(1.佳木斯大學臨床醫學院,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學第一附屬醫院消化一科,黑龍江 佳木斯 154003)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病,其病因和發病機制仍不清楚,目前大多數研究認為細胞因子與 UC的發病有密切關系。細胞因子的表達,可作為檢測 UC疾病嚴重程度的指標[1]。近年來的研究發現,核因子-kB(N F- kB)通過調控細胞因子的轉錄和釋放而調節細胞因子的分泌,促進炎癥反應,導致黏膜損傷發揮著重要作用[2]。轉化生長因子-β(TNF-β)在多種組織細胞的增殖分化、間質形成、組織損傷修復、骨質再生、胚胎發生中起著關鍵作用[3]。同時研究證實 UC的發生與腸道菌群關系密切。近年來,有人嘗試應用益生菌制劑作為治療 UC的藥物,其作用己經得到有效的肯定[4]。本研究采用益生菌制劑美常安治療 UC大鼠,檢測細胞因子 NF- kB和 TGF-β的變化,旨在從細胞水平上探討益生菌對 UC的療效,以期能夠為應用益生菌制劑治療 UC提供證據,從而為臨床提供一個新的治療 UC的方法。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備

選用佳木斯大學動物實驗中心提供的健康 Wistar大鼠30只,雌雄各半,體重270～ 330g,將大鼠隨機分為正常組,模型組 ,美沙拉嗪組,益生菌組,聯合用藥組 ,每組各6只。將30只大鼠禁食不禁水48h,用乙醚淺麻醉后放置于固定器中,正常對照組大鼠以2mL生理鹽水經導管導入結腸,其余四組用5%乙酸1.0mL緩慢注入肛門內約8cm處,將大鼠倒置 10s后用4mL生理鹽水沖洗。3d后,正常對照組和模型組每日給2mL生理鹽水灌胃;SASP組以 0.5g/kg體重 SASP溶液2.5mL每日灌胃一次;益生菌組以12.5g/kg體重美常安溶液2.5mL每日灌胃一次;聯合用藥組上午8時以0.5g/kg體重 SASP溶液灌胃一次和下午4時以12.5g/kg體重美常安溶液每日灌胃一次,7d后處死,剖開腹部,取結腸組織,分別用蒸餾水和生理鹽水沖洗,沿腸系膜剪開,取潰瘍組織至于10%甲醛中固定。

1.2 病理學免疫組化學檢測

將標本常規梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片厚度5 μm,粘于多聚賴氨酸處理后的切片上,染色步驟嚴格按說明書進行。陰性對照切片不加一抗,用0.1mmol/LPBS代替,不出現陽性反應,說明一抗特異性強。在40×10倍光鏡下隨機選擇 6個視野,做免疫反應陽性細胞數計數,實驗中使用兔抗鼠 NF-kB和 TGF-β均購自北京博奧森生物有限公司。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般狀況

正常組大鼠活動如常,反應機警,毛發有光澤,飲食量正常,體重增加;模型組大鼠精神萎靡,毛發無光澤,飲食量減少,體重減輕,出現稀便、血便。各治療組大鼠的一般狀況隨給藥時間延長逐漸好轉,飲食量增加,體重增加,血便消失,聯合用藥組一般狀況改善明顯。

2.2 結腸黏膜肉眼觀察及病理切片檢查

模型組結腸黏膜充血水腫,有多個大小不一的潰瘍形成。益生菌組、SASP治療組和聯合治療組腸壁僅見潰瘍愈合后殘留的痕跡。病理切片顯示模型組有潰瘍形成,腸黏膜上皮細胞壞死脫落,黏膜下淋巴細胞增生并有淋巴濾泡形成,中性粒細胞浸潤,隱窩炎和隱窩膿腫;SASP和益生菌治療組顯示無潰瘍,黏膜固有層內有少數淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性粒細胞浸潤、個別腺腔有灶性上皮壞死;聯合用藥組僅見黏膜上皮內灶性淋巴細胞浸潤,其它無異常發現。

2.3 免疫組化技術檢測細胞因子測定

見表1。

表1 各組大鼠 N F-к B及 TGF-β的變化 ±s,n=6)

表1 各組大鼠 N F-к B及 TGF-β的變化 ±s,n=6)

注:與正常組比較△P＜0.05;與模型組比較☆P＜0.05。

組別 N F-к B TGF-β正常組 9.39± 2.72220.4± 7.276模型組 44.16± 13.134△ 69.4± 19.329△美沙拉嗪組 19.22± 3.981△☆ 34.5±11.412△☆益生菌組 26.92± 8.309△☆ 38.5±12.436△☆聯合治療組 10.21±3.271☆ 25.4±8.079☆

從表1可以看出:①SASP組、益生菌組和聯合用藥組N F-к B、TGF-β表達均低于模型組,有顯著性差異(P＜0.05),說明常規藥物、益生菌及聯合用藥均可有效降低結腸粘膜 NF-к B、TGF-β表達。②聯合用藥組與益生菌組和 SASP組有顯著差異 (P＜0.05),而與正常對照組無顯著差異 (P＞ 0.05),說明聯合用藥治療 UC比單獨用藥效果更佳。③益生菌組和 SASP組 N F-кB、TGF-β表達無顯著差異 (P＞ 0.05),說明效果相當。

3 討論

目前對潰瘍性結腸炎的發病機制普遍認為主要由免疫反應介導,并與遺傳、感染、環境因素等密切相關的慢性炎性疾病,其中細胞因子在 UC的發病中起著重要的作用。研究顯示,N F-кB調控細胞因子的轉錄和釋放,并且細胞因子分泌的增加有關,從而引起炎癥反應。TGF-β有促進細胞外基質合成的作用,激活纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ、Ⅱ、V、Ⅵ等的合成與分泌;直接促進成纖維細胞合成細胞外基質,并對新合成的細胞外基質的降解有顯著的抑制作用。本實驗發現 UC大鼠 NF-кB及 TGF-β表達明顯增加,與正常組相比差異有顯著性,表明了 N F-к B與腸道炎癥的產生有關,是一種調節各種炎癥細胞因子、趨化因子的轉錄因子。在UC的研究過程中,近年來人們開始注意到腸腔內細菌在發病中的重要作用。UC病人的腸黏膜細菌的屏障功能是紊亂的。許多學者開始重視腸道共生菌群的變化,以求在細菌方面找到 UC的發病機制,并且設想用益生菌及其產物來治療UC。本實驗結果證實,應用益生菌美常安和 SASP后,可有效改善癥狀,減輕腸黏膜的病理損害,腸黏膜 NF-кB及TGF-β表達明顯減少,但細胞因子表達與正常對照組尚有顯著差異,而經聯合用藥治療后,更顯著改善大鼠腹瀉癥狀,減輕腸黏膜病理損害,腸黏膜 N F-кB及 TGF-β表達明顯減少,與對照組無顯著差異,說明益生菌、SASP對治療 UC確實有效,而聯合用藥效果更佳。益生菌的作用機制有以下幾種可能:(1)益生菌作用后產生的低分子量多肽具有促進淋巴細胞增殖,而后者能恢復吞噬細胞的功能,從而殺滅和消除已侵入的微生物。(2)益生菌與腸黏膜免疫系統相互協作,維持對炎癥的生理性控制和激活腸道相關性淋巴組織。(3)益生菌可以增強上皮緊密連接以阻止致病菌侵入。益生菌可以通過與致病菌競爭腸上皮微絨毛上的脂質和蛋白質上的相同復合糖(glycoconjugate)受體來達到阻止致病菌的定植。(4)益生菌通過促進損傷上皮的修復,防止致病菌在腸道上皮細胞間的移位。

[1] M Carlson,Y Raab,L Seveus,et al.Human neutrophil Lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis[J].Gut,2002,50:501-506

[2] Rogler G,Brand K,Vogl D,et al.Nuclear factor-κ B is activated in macrophages and epithelial cells of inflamed intestinalmucosa[J].Gastroenterology,1999,115:357-369

[3] 張云燕,石雪蓉.轉化生長因子β的研究進展 [J].四川解剖學雜志,2006,14(3):30-32

[4] 余建新,韓春茂.益生菌的作用機制及臨床應用前景 [J].中國微生態薛雜志,2002,14(6):371-374