青藤堿干預多柔比星腎病大鼠的實驗研究

王麗敏,王麗娜,李春玉,鄒艷紅,王海燕

(佳木斯大學附屬第一醫院兒科,黑龍江 佳木斯 154003)

MCNS是小兒腎病綜合征最常見的類型,其病因與發病機制目前尚未完全明確。IL-6是參與炎癥反應和免疫調節的重要細胞因子之一[1]。現有資料已證實,腎臟系膜細胞、內皮細胞及腎小管上皮細胞均能分泌 IL-6,IL-6可以通過旁分泌和自分泌兩種形式與腎小球系膜細胞上的 IL-6受體結合,促進腎臟系膜細胞增多和基質增生,進而使腎小球濾過膜增厚[2],最終導致腎小球硬化[3]。作為一種免疫抑制劑 SIN主要用于治療風濕性疾病,據文獻報道 SIN亦有減少蛋白尿,降低血中循環免疫復合物,減輕腎小球炎癥反應等腎臟保護作用。本實驗通過制備大鼠多柔比星腎病模型來模擬人類 MCNS,檢測 IL-6在 MCNS大鼠中的異常表達情況及SIN對其的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組

雄性 Wistar大鼠 120只 ,清 潔級 ,體重 90～ 120g,由 佳木斯大學動物實驗中心提供。隨機分為正常組32只、腎病組88只。根據王崢等[4]的方法給予腎病組單次尾靜脈注射多柔比星5mg/kg,制備大鼠多柔比星腎病模型.正常組給予注射等量生理鹽水。4只不合格者剔除。將模型成功的腎病大鼠隨機分成兩組:腎病對照組 44只、治療組 40只。治療組給予SIN36mg/kg.d灌胃,腎病對照組及正常組給予等量生理鹽水灌胃 ,實驗第 7d開始給藥,共 5w。實驗第 7、14、28、42天檢測各組大鼠24 h尿蛋白定量,同時采用 ELISA法檢測各組大鼠尿及腎組織中 IL-6水平。

1.2 方法

1.2.124 h尿蛋白測定:采用考馬斯亮藍法檢測24h尿蛋白定量。

1.2.2 尿 IL-6水平測定:于實驗第 7、14、28、42天收集各組大鼠晨尿,2000r/min離心15min,取上清液2mL,均置于-20℃冰箱保存待檢。

1.2.3 腎組織中 IL-6檢測:于實驗第 7、 14、 28、 42天分批處死大鼠,剖腹取腎,將腎組織勻漿后 2000r/min離心 15min,取上清液 2mL,均置于-20℃冰箱保存。IL-6檢測均采用ELISA法。試劑盒購于武漢博士德生物公司,結果以 pg/mL表示。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠24h尿蛋白定量比較

見表1。

表1 各組大鼠不同時期尿蛋白定量比較 ±s,mg/24h)

表1 各組大鼠不同時期尿蛋白定量比較 ±s,mg/24h)

*與正常組比較 P＜0.01;△與腎病組比較 P＜0.01。

正常組 86.31± 1.296.14± 1.236.25± 1.226.53± 1.15腎病組 1142.11± 5.11* 121.79± 8.29* 202.76± 12.14* 265.61± 17.74*治療組 1041.33± 5.3097.33± 6.84△ 162.66± 10.80△ 111.87± 9.91△F值 179.99 792.30 979.12 1042.43

2.2 各組大鼠不同時期尿液中 IL-6水平比較

見表2。

表2 各組大鼠不同時期尿 IL-6水平比較 ±s,pg/mL)

表2 各組大鼠不同時期尿 IL-6水平比較 ±s,pg/mL)

*與正常組比較 P＜0.01;△與腎病組比較 P＜0.01。

正常組 811.37± 1.9811.76± 1.8312.02± 2.2111.63± 1.83腎病組 1121.29± 4.42* 27.72± 5.11* 37.28± 4.51* 48.55± 4.41*治療組 1020.73± 3.7222.29±3.97△ 28.97± 4.71△ 25.69±3.92△F值 20.27 36.27 88.77 243.56

2.3 各組大鼠不同時期腎組織中 IL-6水平比較

見表3。

表3 各組大鼠不同時期腎組織中 IL-6水平比較 ±s,pg/mL)

表3 各組大鼠不同時期腎組織中 IL-6水平比較 ±s,pg/mL)

*與正常組比較 P＜0.01;△與腎病組比較 P＜0.01。

正常組 889.67± 9.8088.81± 9.9390.51± 8.6789.64± 9.47腎病組 11124.86± 9.87* 186.41± 13.98* 233.79± 15.21* 292.72± 17.04*治療組 10124.82± 9.06144.13± 10.31△ 185.27± 11.05△ 154.75± 9.04△F值 39.04 159.35 316.88 636.97

2.4 相關分析

腎病組24h尿蛋白定量與尿液中 IL-6的表達水平呈正相關 (R=0.794,P＜0.01)。24h尿蛋白定量與腎組織中 IL-6的表達水平呈正相關 (R= 0.870,P ＜0.01)。腎組織中IL- 6與 尿中 IL-6的表 達呈正 相關 (R= 0.739,P＜0.01)。

3 討論

IL-6是一種具有多種生物學活性的細胞因子,作為機體復雜的細胞因子家族中的重要成員,在多種疾病的發生發展中起著非常關鍵的作用。徐佳[5]等的研究表明 IL-6在病理模型組中主要在腎小管上皮細胞和細胞核有表達,在腎小球內亦可見陽性表達。PNS患兒尿中 IL-6顯著高于健康兒童,且尿中 IL-6活性增高并不是由于外周血淋巴細胞分泌IL-6增強所致 ,因此檢測患兒尿 IL-6的水平能更好地反映患兒病情與治療效果,對指導臨床治療具有重要意義[6]。研究發現 N S組 IL-6水平明顯高于N S緩解組及正常對照組,而 NS緩解組 IL-6水平接近正常,提示在 NS病中存在以IL-6增高為特征性的免疫學紊亂[7]。本實驗結果顯示腎病組在注射多柔比星7d后尿中 IL-6的表達逐漸升高 ,42d達到高峰,24h蛋白尿定量在各時期表達情況與正常組相比均有顯著性差異 (P＜0.01),尿液及腎組織中 IL-6的表達情況與24h蛋白尿量均呈正相關 (P＜0.01),且尿液中 IL-6與腎組織中 IL-6的表達也呈正相關 (P＜0.01)。治療組尿液、腎組織中 IL-6及尿蛋白也不同程度的增加,但與腎病組相比較低。目前已證實,腎臟系膜細胞、腎小球上皮細胞和間質細胞等均能產生 IL-6,且 IL-6在腎臟局部又能刺激系膜細胞增殖并分泌其他細胞因子和膠原等進而影響疾病發展。病理情況下,以上細胞產生的 IL-6增多,參與腎臟病理生理過程,并從尿中排出。這也很好的解釋了在尿 IL-6增高的 MCN S患者中,大量蛋白尿的發生率較高 ,腎臟病理改變較重的原因。研究發現[8]經青藤堿干預后,IL-6表達明顯下降,減輕了過量 IL-6表達對免疫系統的損害,從而提高了巨噬細胞的免疫應答能力有關。這與本實驗的研究結果一致。本實驗建立的動物模型較好地模擬了人類 MCNS,同時發現了 IL-6表達的動態變化規律及其與蛋白尿的關系。本研究發現尿液及腎組織中 IL-6與 24h蛋白尿呈正相關,尿液中IL-6與腎組織中 IL-6的表達呈正相關,故尿液中 IL-6的水平可以反映出腎組織中 IL-6的水平。而 SIN能有效的抑制腎組織及尿中 IL-6的表達 ,減輕 MCNS大鼠尿蛋白、保護腎功能,促進腎臟病理損害的修復。

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[6] 陳英,高巖.白細胞介素在小兒原發性腎病綜合征發病機制中作用的研究現狀[J].醫學綜述,2008,14(6):908-911

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