基于液質聯用技術艾滋病病毒攜帶者、艾滋病患者脾肺氣虛證者尿液的代謝組學研究

謝世平 馬素娜 劉偉 陳玉龍 崔永霞 許前磊 張寧 王娟 溫冠曉

代謝組學是繼基因組學、蛋白組學之后發展起來的一門新組學，已廣泛應用于醫學領域，它通過運用現代儀器檢測分析手段，定性或定量研究觀察生物樣本中所有可檢測的代謝產物的綜合表現，探討生物體對外源性物質以及遺傳變異的應答等所引起的病理生理變化反應，將這些變化反應與代謝信息中的生物學相關事件聯系起來，以檢測活細胞中的化學變化及其生物學意義［1］。由于其具有與中醫學整體觀、即時性相一致的特點，將成為生命科學研究者研究中醫“證”本質的有力工具［2］。通過運用代謝組學的研究方法，尋找艾滋病患者尿液中的特異代謝產物，為中醫藥在診斷和防治艾滋病進展中的作用提供先進的技術支持。

1 對象與方法

1.1 對象

共納入研究對象20例，均為漢族，農民。其中疾病觀察組12例均為來源于河南省某地區的艾滋病病毒攜帶者、艾滋病患者(HIV/AIDS)脾肺氣虛證者。健康對照組8例，均為當地健康人。疾病觀察組:男6例(50%)、女6例(50%);年齡31～40歲1例(8.3%)、41～50歲 6例(50%)、51～60歲 5例(41.7%);已婚9例(75%)、離異1例(8.3%)、喪偶2例(16.7%)。健康對照組:男4例(50%)、女4例(50%);20～30歲1例(12.5%)、31～40歲1例(12.5%)、41～50歲3例(37.5%)、51～60歲3例(37.5%);已婚7例(87.5%)、未婚 1例(12.5%)。經統計學分析兩組對象一般資料差異無顯著性。

1.2 診斷標準

西醫診斷標準采用國家衛生部2005年推薦《艾滋病診療指南》診斷標準:有流行病學史、實驗室檢查HIV抗體陽性。

中醫辨證標準:以課題組前期對HIV/AIDS患者大樣本中醫證候學的臨床調查的研究成果為基礎［國家自然科學基金項目(90409004):艾滋病中醫證候分布規律及證候標準建立與驗證］，擬定艾滋病中醫常見基本證候辨證標準中脾肺氣虛證的診斷標準。中醫證候脾肺氣虛證相關的癥狀和體征:動則氣喘、易感冒、咳痰清稀、咳聲低微、自汗、神疲乏力、惡風寒、心慌心悸、胸悶、泄瀉、便溏、舌體胖大、舌質淡或淡白、舌苔薄白、脈象虛或細弱等。

1.3 納入標準

疾病觀察組的納入標準:(1)HIV確認試驗陽性;(2)符合《HIV/AIDS常見中醫證候診斷量表》中脾肺氣虛證診斷標準，中醫辨證須經兩名副主任中醫師以上職稱醫生診斷一致;(3)年齡在18～60歲;(4)簽署知情同意書。

健康對照組的納入標準:(1)HIV抗體陰性;(2)身體健康無臟器嚴重疾病或慢性病急性發作者;(3)無神志不清、癡呆、各種精神病患者;(4)非妊娠或哺乳期婦女;(5)年齡在18～60歲之間;(6)能配合調查并簽署知情同意書。

1.4 排除標準

(1)不符合以上納入標準者;(2)非因感染艾滋病所患的臟器嚴重疾病，原發性免疫缺陷，激素化療等引起的繼發性免疫缺陷，血液病，其它原因引起的中樞神經系統疾病。

1.5 儀器及試劑

主要儀器設備:LCQ Advantage MAX電噴霧離子阱液質聯用儀(美國賽默飛世爾科技公司);色譜柱(Agilent Zorbax C18)(150 ×2.1mm，3.1μm);高速冷凍離心機(Jouan MR23i)(法國Jouan公司);低溫冰箱(MDF5411)(日本三洋株式會社);超純水器(MiII-QSyntheSiS)(美國MiIIPore公司);KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

主要試劑:乙腈(色譜純級，購自Merck公司);甲酸 (HPLC/SPECTRO級，購自Tedia公司);甲醇(色譜純級，購自 Merck公司);高純氮氣(純度＞99.99%);高純氦氣(純度＞99.99%)。

1.6 尿液樣品的預處理

用EP管收集正常對照組、脾肺氣虛證組和濕熱內蘊證組研究對象的晨尿2 ml，移取1 ml尿液，4000轉/分高速離心10分鐘，取上清液。精密移取上清液 300 μl，置 1.5 ml離心管中，加入 600 μl甲醇，用混勻器混勻約10分鐘，然后高速離心10分鐘，14000 轉/分，4 ℃ 控溫，取上清液 800 μl，用0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液，低溫冰箱保存。

1.7 液相色譜—質譜條件

(1)液相色譜條件:色譜柱為Agilent Zorbax C18(150×2.1 mm，3.1 μm);流動相:0.2%冰醋酸水—甲醇梯度洗脫(見表1);流速:0.2 ml/min;進樣盤溫度:4℃;進樣量:20 μl;柱溫:30℃;色譜圖采集時間不少于60分鐘。(2)質譜條件:掃描方式:一級全掃描;鞘氣流速:4000 kpa;輔助氣流速:1000 kpa;噴霧電壓:4 kV;毛細管電壓:-4 V;毛細管溫度:300℃，質荷比范圍:80～1000，采用負離子掃描模式。

1.8 液質聯用分析方法學考察

(1)空白溶劑考察:取供試品制備所用甲醇—水(2∶1)，按照梯度洗脫條件進樣，考察空白溶劑產生的干擾，對數據進行分析時，扣除空白溶劑的干擾。(2)精密度試驗考察:取供試品溶液(如正常對照組10號樣本)，重復進樣6次，以總離子流圖中各色譜峰的保留時間和峰面積為指標，考察儀器的精密度，多次測量樣本相對標準偏差RSD% ＜3%。(3)重復性試驗考察:取同一患者的尿液，分別制樣6份，行色譜分析，以總離子流圖中各色譜峰的保留時間和峰面積為指標，考察方法的重復性，RSD% ＜3%;(4)穩定性試驗考察:取供試品溶液(如健康對照組10 號樣本)，分別于 0、1、2、4、8、12 小時穩定電壓行色譜分析，以總離子流圖中各色譜峰的保留時間和峰面積為指標，考察樣品穩定性，RSD% ＜3%。

表1 液相色譜法冰醋酸水—甲醇洗脫梯度表

1.9 數據分析

(1)經質譜分析儀器自帶軟件導出原始數據(質荷比對應的峰強度)Excel文件，對數據進行篩選，篩選原則為:每個證型中相同質荷比(數據上下浮動在±1的定義為同一類物質)。(2)對所篩選出的差異結果通過SPSS 13.0軟件進行t檢驗分析，P＜0.05有統計學意義。根據P值、各組間相同質荷比均數(同一質荷比對應的不同分組中所有樣本峰強度的均數)的比值(以1.5倍原則)進行篩選，篩選出差異物質，通過比較兩組間相應代謝產物的峰值明確其變化的趨勢(增多或減少)。(3)對其中有顯著差異的數據采用PCA模式識別分析。

2 結果

2.1 方法學考察

空白溶劑考察結果顯示試劑無干擾;精密度考察、重復性和穩定性考察結果表明儀器精密度良好、方法的重復性和穩定性良好。

2.2 指紋圖譜(見圖1～2)

2.3 t檢驗分析

從圖3可以看出在HIV/AIDS脾肺氣虛證組中質荷比分別為 794、618、339、502、118、384 的 6 種物質與正常組相比峰強度均減小，且相差大于1.5倍。質荷比為 412、413、368、229、286、287、325、327、529、299、210、347、311、329、331、303、345、523、505、295、300、213、521、507、293、365 的 26 種物質在HIV/AIDS脾肺氣虛證組峰強度明顯的高于健康對照組，相差遠大于1.5倍。兩組物質經t檢驗均P＜0.05，差異有明顯性。其中質荷比為412、505、794、118、329、331 的 6 種物質，在兩組中峰度均較高且兩組差異明顯。可能為兩組間的特異性物質。

2.4 PCA分析結果

數據用正交信號校正(Orthogonal Signal Correction，OSC)后進行偏最小二乘模式識別(Partial Least Squares-discriminant analysis，PLS-DA)分析。從變量散點圖(plot)中可發現顯著差異的變量，即為“生物標志物”。

從圖4中可以看出:健康對照組(■所示)和HIV/AIDS脾肺氣虛證組(◆所示)兩組間能明顯的區分開，兩組之間存在顯著的差異。

從圖5中可以看出在分子量為352、388、618、562、502、159、560、384、794、109、101、118、117、125、339的離子物與其他離子相距較遠，可以認為是艾滋病病人脾肺氣虛證組相對于健康對照組的潛在標志物。

從圖6中可以看到:第一主成分:R2Y=0.59，Q2=0.51;第二主成分:R2Y=0.86，Q2=0.75，這說明:第一主成分代表了整體信息的程度為59%左右，預測率為51%左右;第二主成分可以代表整體樣本信息的程度為27%左右，預測率為24%左右。前兩個主成分對整體樣本信息的覆蓋程度為80%，整體預測率為75%。這可以認為是一個很理想的模型，它對大部分的數據(主成分)都能進行解釋，且預測率較高，預測能力強，結果意義可信。

3 討論

圖5 健康對照組與脾肺氣虛組PLOT圖

中醫藥認識疾病的方法、理論均缺乏合適的現代科學表達體系，目前仍是一種不能與現代醫學相兼容、相通的“語言”。要進一步實現中醫藥的現代化和國際化，其根本在于用現代科學語言闡釋中醫獨特的理論體系。代謝組學通過獲取體內動態變化的綜合信息了解人體可能受影響的部位和環節，這與傳統中醫學“思外揣內”的診治方法具有內在的同一性，代謝組學是一種較全面的系統的研究技術，在方法學上具有融整體、動態、綜合、分析于一體的特點，采用代謝組學這種現代醫學承認的尖端技術可以克服中醫傳統方法的局限，成為適合現代中醫藥研究的重要技術手段，成為溝通中醫和現代醫學的橋梁。而且無論是中醫的“證”還是代謝組學，研究的都是致病因素作用于人體后機體某一階段反映的病理性變化的綜合情況，二者皆從機體整體變化的角度進行評價分析，共同體現了即時性、整體性的特點。中醫“證”是辨證論治的起點和核心，應用代謝組學技術可以分析中醫證候的特異性代謝產物或標志物，進而促進中醫證候的客觀化和證本質的研究，為中醫證候診斷的量化、客觀化和標準化提供方法和依據［3］。

本研究運用液質聯用技術與主成分分析方法相結合來研究HIV/AIDS脾肺氣虛證患者與健康對照研究對象的尿液代謝輪廓的差異，結果顯示該方法能夠將兩組間的尿液代謝輪廓進行良好的區分(PLS-DA圖)，HIV/AIDS脾肺氣虛證患者組相對與健康對照組存在著顯著的差異物質或物質群(PLOT圖)。基于液質聯用技術結合PCA模式識別的代謝組學的研究方法是一種可以用于研究機體復雜病理生理變化的先進的技術方法，或許可以成為揭示中醫證候本質研究的強有力的工具。

本次研究通過探索HIV/AIDS脾肺氣虛證的代謝物質的差異，嘗試為中醫藥在診斷和防治艾滋病進展中的作用研究提供嶄新的思路，嘗試為中醫證本質研究，更為臨床多種疾病的診斷和防治提供新的思路和方法。

［1］Nicholson JK，Connelly J，Lindon JC，et al.Metabonomics:a platform for studying drug toxicity and gene function［J］.Nat Rev Drug Discov，2002，1(2):153-161.

［2］徐舒，陳合兵，李洪，等.“肝郁證”大鼠模型的建立及代謝組學的初步研究［J］.中華中醫藥雜志，2009，24(6):787-791.

［3］溫淑云，酈永平.中醫證候量化分析研究述略［J］.實用中醫內科雜志，2007，21(5):5-6.