艾灸對類風濕關節炎模型大鼠跖關節中細胞因子的影響

羅磊 胡玲 宋小鴿 唐照亮 何璐 蔡榮林 郝峰

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以對稱性多關節炎為主要臨床表現的異質性、系統性、自身免疫性疾病。據報道，中國的RA患病率0.32% ～0.36%左右［1］。歷代中醫典籍中雖沒有記載類風濕關節炎這個病名，但依據其疼痛遍歷肢節等臨床癥狀而言，當屬中醫學“痹病”、“歷節”、“痛風”等范疇。局部關節疼痛為類風濕關節炎的主要癥狀。本課題組前期研究表明，艾灸能顯著改善類風濕關節炎模型大鼠局部和全身癥狀，減輕關節腫脹，提高大鼠進食、進水量，并能有效調節大鼠血清中白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子(TNF)含量，改善神經免疫調節機制，糾正炎癥時自由基代謝紊亂，誘導滑膜炎癥細胞凋亡、改善局部關節滑膜細胞超微結構［2-8］。本研究以RA模型大鼠局部跖關節中細胞因子為研究對象，進一步揭示艾灸的局部抗炎免疫機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

Wistar大鼠，由南京醫科大學實驗動物中心提供［合格證號:SCXK(蘇)2008-0004］，清潔級，雄性，月齡3～4月，體重180～220 g，120只。

大鼠適應性喂養一周后，按照《衛生統計學》隨機數字表［9］隨機抽取20只為正常組，放于室溫18～20℃動物房內常規喂養，正常飲水進食。其余大鼠進行模型復制，模型復制成功后，隨機分為模型組、藥物組、針刺組、艾灸組、CO2激光組，每組20只。模型組不做任何處理，其余各組分別給予相應治療。整個實驗過程均按照實驗動物倫理學的規定進行。

1.2 主要試劑及儀器

特制香煙型純艾條(Φ=5 mm，南陽市臥龍漢醫艾絨廠，061205);漢醫針灸針(天津杏林書院醫療器械有限公司，040601);雷公藤多甙片(上海復旦復華藥業有限公司，070402);弗氏完全佐劑(美國SIGMA公司，10 ml，068K8761);IL-1免疫組化試劑盒(北京博奧森，908267W);IL-2免疫組化試劑盒(北京博奧森，906234H);TNF免疫組化試劑盒(北京博奧森，862471K)。

自制鋁合金、玻璃造模箱:1.2 m×1.0 m×0.8 m(1 m×0.6 m×0.5 m);CO2激光治療儀(ML015-CA，上海萬奇光電技術有限公司);高效熒光顯微鏡(Olympus，BX51);數碼照相裝置(Olympus，DP70)。

1.3 模型復制

采用風、寒、濕環境因素加生物因子復合造模方法［4］，復制RA模型大鼠。將大鼠放置在可控制溫度、濕度的自制造模箱內，使箱內溫度控制在(6±2)℃，濕度80% ～90%。所有需要造模的大鼠均放入上述造模箱中20天(12小時/天)(20∶00-8∶00)。第21天給大鼠足跖部注射完全弗氏佐劑0.15 ml/只，建立RA大鼠模型。觀察3天，以24小時出現足踝部急性炎癥腫脹，48小時出現繼發性全身多發性關節炎，表現為前肢或對側肢體甚至耳、尾部紅腫或炎性結節出現，示模型復制成功。

1.4 取穴與治療方法

參照文獻［2-7］，選取“足三里”和“腎俞”穴，根據“大鼠穴位圖譜”，分別作穴區定位，剪去各穴區被毛，標記顏色。致炎造模3天后，艾灸組用特制香煙型純艾條距穴2 cm處懸灸;CO2激光組應用10.6 μm CO2激光治療儀進行穴位照射，輸出端距穴2 cm，激光光斑直徑為2 mm;針刺組用1寸毫針(25 mm)于穴區消毒后快速進針，針刺深度參考《實驗針灸學》。各組治療時，“腎俞”、“足三里”二穴交替使用，每天一穴(雙側)，每天1次，每次20分鐘，連續治療15天;藥物組進行雷公藤溶液灌胃給藥，濃度為 1.6 mg/ml，劑量按 8 mg/(kg·d)，即每100 g大鼠灌胃0.5 ml，每天1次，共灌藥15天，平均總量為 24 mg/只，計 15 ml［10］。正常組和模型組大鼠不作任何治療處理。

1.5 取材方法

實驗第39天，用1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰位固定，取大鼠右足跖關節。脫鈣固定，待測，檢測方法參照免疫組化試劑盒說明。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠行為觀察

正常組大鼠皮毛光澤，色白，精神佳，活動自如，反應靈敏，飲食正常。致炎造模后，可觀察到模型組大鼠皮毛黯淡發黃、糾結無光澤，尾部出現數量不一、程度不等的結節，部分大鼠爬行困難，病變累及未注射弗氏完全佐劑(FCA)的足爪，納食減少，大便稀軟，脫毛情況較嚴重。然而，其它各治療組大鼠的毛發、進食飲水量，活動度等方面均可觀察到不同程度的改善。

2.2 跖關節中細胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α 的測定結果

模型組大鼠跖關節中IL-1β、TNF-α的平均光密度和灰度與正常組比較顯著性增高(P＜0.01，或P＜0.05)，IL-2的平均光密度和灰度顯著性降低(P＜0.01)，說明模型組大鼠局部跖關節中細胞免疫紊亂，Th1/Th2失去平衡，炎性反應明顯。經15天治療后，艾灸組、針刺組及CO2激光組均能下調類風濕關節炎大鼠跖關節中IL-1β、TNF-α的平均光密度和灰度，上調IL-2的平均光密度和灰度，與模型組比較差異性顯著(P＜0.01或P＜0.05)，與雷公藤多甙藥物組比較無顯著性差異(P＞0.05)，說明艾灸、針刺及CO2激光穴位照射具有降低局部跖關節中促炎癥細胞因子IL-1β和TNF-α，提高T細胞生長因子IL-2的效應，良性調整Th1/Th2平衡，糾正細胞免疫紊亂，與雷公藤多甙治療效果相當。見表1和圖1～2。

3 討論

艾灸療法起源于中國，源遠流長，是針灸醫學的重要組成部分，也是中醫防病治病的一個重要手段。灸法可治寒、熱、虛、實諸證，對百余種病癥有很好的療效，具有廣泛的適應證，其獨特的診療方法、顯著的療效和豐富的文獻資料是人類傳統醫學的寶貴財富。灸法治療類風濕關節炎，是中國傳統醫學的特色之一，在國際上獨樹一幟?！肚Ы鸱健份d:“歷節風痛，但痛處灸二七壯，佳?！薄侗怡o心書》:“于痛處灸五十壯自愈?！闭n題組前期研究已證實，艾灸對RA大鼠有明顯的鎮痛、抗炎、消腫作用，灸治“腎俞”、“足三里”穴不僅能抑制血清中 TNF、IL-1等炎癥因子的釋放，改善與增強機體的免疫功能，糾正炎癥時自由基代謝的紊亂，而且亦存在誘導滑膜炎癥細胞的凋亡、改善滑膜細胞超微結構等多方面作用［2-8］。

細胞因子是一類由免疫細胞和相關細胞經刺激而分泌的具有高活性、多功能的小分子蛋白質的統稱。在很多情況下，多種免疫細胞間的相互作用是通過細胞因子介導的，細胞因子通過作用于靶細胞的特異受體而表現其活性［11］。根據細胞因子的傳統名稱和生物學特性可以分為:白細胞介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、生長因子(GF)、趨化性細胞因子等。大量研究發現艾灸足三里、腎俞、關元穴能明顯升高血清中IL-2的水平，降低血清IL-1、IL-6、TNF、一氧化氮(NO)的水平，從而在一定程度上增強和改善機體的免疫機能，糾正機體免疫紊亂［12，13］。

表1 不同組別大鼠IL-1、IL-2、TNF-α 比較(±s，n=20)

表1 不同組別大鼠IL-1、IL-2、TNF-α 比較(±s，n=20)

注:與模型組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01;與正常組比較，cP ＜0.05，dP ＜0.01;與艾灸組比較，eP＜0.05。

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通過文獻檢索發現，在探討艾灸治療類風濕關節炎的作用機制過程中，多數集中在對模型大鼠血清中細胞因子的觀察，較少見對類風濕關節炎局部病變影響的報道。本實驗研究發現，模型組大鼠跖關節中促炎癥細胞因子IL-1、TNF含量顯著增高，生長因子IL-2水平顯著降低，與正常組比較差異較大;而且各治療組均能不同程度的下調跖關節中的IL-1、TNF含量，上調IL-2含量。這一結果與大鼠行為學的改善相類似。表明艾灸對局部關節組織中細胞因子的紊亂具有良性調節作用。結合前期基礎發現，艾灸不僅能夠調節全身血清中細胞因子紊亂，而且對局部關節組織中的細胞因子亦存在調整作用。這一結果表明，艾灸對局部關節組織中細胞因子的調節亦是其抗炎免疫機制之一。然而大多數研究主要集中在促炎因子如IL-1、TNF等細胞因子的研究上，其他細胞因子也可能參與了艾灸免疫調節作用，如IL-4、IL-10、IL-13等抑炎因子的參與。因此，從促炎因子和抑炎因子兩個方面，即從Th1/Th2平衡調節方面，并以全身血液和局部關節為研究載體觀察艾灸抗炎免疫機制，還有待于進一步研究。

通過研究結果發現，艾灸組、針刺組與藥物雷公藤多甙組具有相似的效應，均能不同程度的改善局部關節中細胞因子的紊亂，提示艾灸療法與針刺療法同樣存在抗炎免疫的作用，其對IL-1、IL-2、TNF的影響可能是共同的抗炎免疫機制，至于艾灸與針刺間是否存在特異性抗炎免疫機制，仍待進一步探討。

本實驗所采用的ML015-CA型10.6 μm CO2激光治療儀為模擬艾灸效應的新型激光治療儀。而波長為10.6 μm的CO2激光，能在表皮0.2 mm內被吸收，使皮膚表面溫度明顯提高，其熱效應較為持久［14］，且具有模擬艾灸的效應［15，16］。同時，本實驗結果發現波長為10.6 μm的CO2激光亦存在下調IL-1、TNF水平，上調IL-2水平的作用，與艾灸抗炎免疫效應相似。因此，艾灸在治療RA過程中所產生的紅外光譜可能是艾灸發揮抗炎免疫效應的機制之一。但是CO2激光穴位照射的效應是否可與艾灸的效應等同;其他波長的CO2激光或其他激光照射是否具有類似的作用;艾灸治療過程中的溫熱刺激是否存在一定作用;艾葉本身的有效成分——艾油等作用于局部穴位后是否亦存在類似的效應，仍需進一步深入探討，為探明艾灸發揮治療效應的作用原理及其內在機制提供準確而全面的依據。

［1］陸在英，鐘南山.內科學［M］.7版.北京:人民衛生出版社，2008:848.

［2］唐照亮，宋小鴿，章復清，等.艾灸治療類風濕性關節炎抗炎免疫作用機理的研究［J］.針刺研究，2003，28(4):292-298.

［3］唐照亮，宋小鴿，王寧新，等.艾灸對佐劑性關節炎大鼠滑膜細胞凋亡及病理組織的觀察［J］.中醫藥學刊，2004，22(2):226-227.

［4］胡玲，Dirckinck-Holmfeld Lars，宋小鴿，等 .Effect of Moxibustion on IL-1β and IL-2 in rat Models of Rheumatoid Arthritis［J］.Journal of Acupuncture and Tuina Science，2010，8(3):149-153.

［5］唐照亮，宋小鴿，侯正明，等.艾灸抗炎與免疫作用的基礎實驗研究［J］. 針刺研究，1997，22(3):168.

［6］唐照亮，宋小鴿，章復清，等.艾灸對關節炎大鼠抗炎消腫作用及細胞因子、自由基影響［J］.安徽中醫學院學報，2001，20(5):34-36.

［7］宋小鴿，唐照亮，侯正明，等.艾灸對實驗性炎癥大鼠抗炎作用和紅細胞免疫功能的影響［J］.中國中醫藥信息雜志，1999，6(12):31.

［8］羅磊，胡玲，宋小鴿，等.艾灸對類風濕性關節炎大鼠關節滑膜細胞超微結構的影響［J］.針刺研究，2011，4(2):105-109.

［9］倪宗瓚.衛生統計學［M］.4版.北京:人民衛生出版社，2002:267.

［10］范祖森，曹容華，張慶殷，等.雷公藤多甙對大鼠佐劑性關節炎治療作用和免疫機制的研究［J］.中國藥理學通報，1996，12(6):527-529.

［11］吳敏毓，劉恭植.醫學免疫學［M］.合肥:中國科學技術出版社，2005.

［12］謝甦，李麗紅.艾灸關元、足三里對衰老小鼠免疫功能影響的試驗研究［J］.貴陽中醫學院學報，2003，25(2):44.

［13］王光義，鐘小蓓，賀志光.穴位埋線加艾灸對佐劑型關節炎大鼠P物質含量的影響及其對細胞因子的免疫調控作用［J］.針灸臨床雜志，2005，21(7):51-52.

［14］Makihara E，Makihara M，Masumi S，et al.Evaluation of facial thermographic changes before and after low-level laser irradiation［J］.Photomedicine and Laser Surgery，2005，23(2):191-195.

［15］Zhao L，Shen XY，Gao JP，et al.Effect of Different LLLT on Pituitrin Induced Bradycardia in the Rabbit［J］.Lasers Med Sci，2006，21(2):61-66.

［16］席明健，趙玲，沈雪勇，等.犢鼻穴復合激光針灸治療膝骨性關節炎的有效性和特異性［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(26):5075-5078.