艾迪注射液對大腸癌細胞的生長抑制作用觀察及相關(guān)機制探討

張俊華，張銀旭，左 騰，王亞華

(1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001;2遼寧省興城市核工業(yè)部246醫(yī)院)

臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，艾迪注射液是有確切療效的抗癌制劑，但其作用機制仍不十分明確。從中醫(yī)學(xué)的角度來說，瘀血內(nèi)阻是發(fā)生惡性腫瘤的重要病機。2011年3～9月，我們觀察了艾迪注射液對大腸癌SW620細胞的生長抑制作用，并通過誘導(dǎo)人單核白血病細胞(THP-1)分化成為M2型巨噬細胞(M2φ)建立模擬腫瘤的微環(huán)境，觀察大腸癌SW620細胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化情況，以探討艾迪注射液抗腫瘤的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人單核白血病細胞(THP-1)，SW620細胞。佛波酯，IL-4，RPMI1640培養(yǎng)液，胎牛血清，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，胰酶及噻唑藍(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)。艾迪注射液。TranswellTM培養(yǎng)板，CD68及 CD163流式抗體，E-鈣黏素(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)。蛋白免疫印跡相關(guān)抗體及ELISA試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 艾迪注射液對SW620細胞的抑制作用觀察

采用MTT實驗。選對數(shù)生長期的SW620細胞，以每孔5 000個接種于96孔板，貼壁后棄去培養(yǎng)液，分別加入終濃度為 20、40、60、80、100 mg/ml的艾迪注射液100 μl(實驗組)，以不加艾迪注射液、正常培養(yǎng)的SW620細胞作對照(對照組)。兩組培養(yǎng)3 d后棄去上清，各加入100 μl的MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，加入DMSO顯色后測各組光密度值(OD值)。實驗組SW620細胞生長抑制率=(OD對照組－OD實驗組)/OD對照組×100%。

1.2.2 模擬腫瘤微環(huán)境的建立 將THP-1細胞置于含10%胎牛血清、2 g/L碳酸氫鈉、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素及20 mmol/L HEPES的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d傳代1次。取對數(shù)生長期THP-1細胞按2.5×105/ml的密度接種于6孔板中，每孔加入含200 nmol/L佛波酯的培養(yǎng)液4 ml，培養(yǎng)3 d。用PBS充分洗滌3次，去除不貼壁和死亡細胞。每孔加入含10 ng/ml的 IL-4 10 ng/ml培養(yǎng)液24 h，流式細胞儀檢測其表面CD68、CD163抗原為陽性，證明THP-1已被誘導(dǎo)分化成M2φ。收集M2φ，接種于TranswellTM培養(yǎng)板的上層小室里，即為體外腫瘤微環(huán)境模型。

1.2.3 艾迪注射液對模擬腫瘤微環(huán)境中細胞培養(yǎng)上清液 TNF-α、TGF-β 及 SW620 細胞 E-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響 將相同數(shù)目對數(shù)生長期的SW620接種于上述Transwell培養(yǎng)板下層小室，分別加入終濃度為20、60、100 mg/ml的艾迪注射液作為實驗組，以不加艾迪注射液、單獨培養(yǎng)的SW620細胞以及不加艾迪注射液、接種于上述TranswellTM培養(yǎng)板下層小室的SW620細胞作對照(分別為對照1、2組)。于 24、48、72 h 收集各組培養(yǎng)上清液，用ELISA法測TNF-α、TGF-β;收集各組模型底層小室里的 SW620細胞，用 Western blot法測細胞中的E-cadherin、Vimentin蛋白(以目的蛋白灰度值與βactin灰度值的比值表示)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)比較用t檢驗、方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艾迪注射液對SW620細胞的抑制作用 20、40、60、80、100 mg/ml的艾迪注射液對 SW620 細胞的生長抑制率分別為37.35%±3.47%、45.91%±4.59%、76.39%± 2.33%、81.55%± 1.84% 及83.27%±1.56%，隨艾迪注射液濃度的增加，細胞的生長抑制率逐漸上升(P均＜0.05)。

2.2 各組細胞培養(yǎng)液中TNF-α、TGF-β的表達比較見表1。

2.3 各組SW620中E-cadherin、Vimentin的表達比較 見表2。

3 討論

表1 各組細胞培養(yǎng)液中 TNF-α、TGF-β的表達比較(ng/ml，±s)

表1 各組細胞培養(yǎng)液中 TNF-α、TGF-β的表達比較(ng/ml，±s)

注:與對照1 組相比，*P ＜0.05;與對照2組相比，△P ＜0.05;與同組前一時間點相比，#P ＜0.05

組別 TNF-α TGF-β 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h實驗組20 mg/ml 35.23±0.92＊△ 0.35±2.46*#△ 14.97±1.92*#△ 2.34±0.22＊△ 3.45±0.30*#△ 4.46±0.39*#△60 mg/ml 11.63±1.72＊△ 11.63±1.72＊△ 7.38±2.33*#△ 0.89±0.31＊△ 0.67±0.27*#△ 0.56±0.44*#△100 mg/ml 0.75±0.27＊△ 0.39±0.93＊△# 0.66±0.53＊△ 0.73±0.26＊△ 0.57±0.38*#△ 0.67±0.40＊△對照1 組 36.35±0.45 37.66±0.36#△ 39.32±0.32#△ 3.37±0.21 4.35±0.31#△ 5.46±0.19#△對照2 組 38.24±0.31* 39.88±0.42*# 40.37±0.54*# 4.13±0.32* 5.07±0.41*# 6.67±0.39*#

表2 各組SW620中E-cadherin、Vimentin的表達比較(±s)

表2 各組SW620中E-cadherin、Vimentin的表達比較(±s)

注:與對照1 組相比，*P ＜0.05;與對照2組相比，△P ＜0.05;與同組前一時間點相比，#P ＜0.05

組別E-cadherin Vimentin 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h實驗組20 mg/ml 0.42±0.01＊△ 0.36±0.02*#△ 0.24±0.13*#△ 0.32±0.03＊△ 0.37±0.13*#△ 0.56±0.19*#△60 mg/ml 0.36±0.10＊△ 0.38±0.03*#△ 0.39±0.10＊△ 0.12±0.05＊△ 0.20±0.03*#△ 0.37±0.02*#△100 mg/ml 0.25±0.11＊△ 0.36±0.14*#△ 0.46±0.18*#△ 0.10±0.03＊△ 0.06±0.03*#△ 0.01±0.01*#△對照1 組 0.98±0.32△ 0.98±0.29△ 0.97±0.30△ 0.01±0.01 0.01±0.01△ 0.01±0.01△對照2 組 0.78±0.20* 0.43±0.24*# 0.22±0.23*# 0.33±0.04 0.48±0.07*# 0.89±0.10*#

艾迪注射液的主要成分是人參、黃芪、刺五加、斑蝥的提取物，在臨床中廣泛用于治療原發(fā)性肝癌、肺癌、腸癌、等多種腫瘤。本研究結(jié)果顯示，艾迪注射液抑制了大腸癌SW620細胞的生長，其抑制率隨著藥物濃度的增加而上升。

腫瘤微環(huán)境中的各種細胞，如腫瘤相關(guān)巨噬細胞、肥大細胞、癌癥相關(guān)成纖維細胞、表達TIE-2的單核細胞、中性粒、淋巴細胞以及樹突狀細胞等都起到各種促進或抑制腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的作用［1］。其中M2φ的作用較為突出，且與上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生有關(guān)。TNF-α是一種有廣泛作用的細胞因子，它能造成一些腫瘤細胞系的壞死，但通過Snail途徑也能誘導(dǎo)細胞發(fā)生增殖與分化［2］。不少學(xué)者的研究證實TGF-β的高表達能促進上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生［3～5］。

E-cadherin是鈣黏素超家族中的一員，它的表達降低會造成組織細胞間的黏附力下降，且增加細胞的活動能力，使其能穿過基底膜，侵犯周圍組織，造成腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［6］。Vimentin是間質(zhì)細胞表達的一種Ⅲ型中間絲，是間質(zhì)細胞骨架的重要組成部分，在保持細胞完整性方面發(fā)回重要作用，常用作間質(zhì)細胞的標記物［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，在模擬腫瘤位環(huán)境中，不加入艾迪注射液時，培養(yǎng)上清液中 TNF-α、TGF-β 表達增加，E-cadherin的表達減少，Vimentin的表達增加，證實M2φ在和SW620共培養(yǎng)時促進了SW620細胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而使其具有遠端轉(zhuǎn)移的能力。另外，在模擬腫瘤位環(huán)境中加入艾迪注射液后，隨著藥物濃度增加及培養(yǎng)時間的延長，細胞培養(yǎng)液中TNF-α和TGF-β的表達逐漸降低，說明艾迪注射液降低了這兩種物質(zhì)的表達，抑制了SW620細胞的增殖以及上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化;同時隨著艾迪注射液濃度增加及培養(yǎng)時間的延長，SW620細胞的E-cadherin表達逐漸增加而Vimentin的表達逐漸恢復(fù)未加藥時的低水平。由此認為艾迪注射液的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了大腸癌SW620上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化。

［1］Peddareddigari V，Wang DZ，DuBois R.The tumor microenvironment in colorectal carcinogenesis［J］.Cancer Microenvironment，2010，3(1):149-166

［2］Yamauchi Y ，Kohyama T，Takizawa H，et al.Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1［J］.Experimental lung research，2010，36(1):12-24.

［3］Flier SN，Tanjore H，Kokkotou EG，et al.Identification of epithelial to mesenchymal transition as a novel source of fibroblasts in intestinal fibrosis［J］.Biol Chem，2010，285(26):20202-20212.

［4］Stover DG，Bierie B，Moses HL.A delicate balance:TGF-beta and the tumor microenvironment［J］.Cell Biochem，2007，101(4):851-861.

［5］Zavadil J，Bottinger EP.TGF-beta and epithelial to mesenchymal transitions［J］.Oncogene，2005，24(11):5764-5774.

［6］于秀文，榮瑋，徐鳳琳，等.黏蛋白和上皮鈣粘附蛋白在結(jié)直腸腫瘤組織中的表達及其意義［J］.癌癥，2007，26(11):1204-1210.

［7］Otsuki S，Inokuchi M，Enjoji M，et al.Vimentin expression is associated with decreased survival in gastric cancer［J］.Oncol Rep，2011，25(5):1235-1242.