嗜麥芽窄食單胞菌磺胺類耐藥與整合子的相關性研究

杜江東，牟肖東，閆志勇，王 斌*

(1青島大學，青島266071;2青島大學醫學院附屬煙臺毓璜頂醫院)

嗜麥芽窄食單胞菌(SMA)廣泛存在于自然界，為條件致病菌，由于其致病力低，臨床上一直未引起重視。磺胺類藥物是治療SMA有效藥物之一，但近年來報道其耐藥率不斷增加，并與整合子有關。2010年5月～2011年5月，本研究以51株SMA為研究對象，觀察了其磺胺耐藥基因和整合子的存在情況。現報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 菌株來源:51株SMA分離自煙臺毓璜頂住院患者臨床標本，其中大于60歲者38例，占74．5%;45例分離自痰標本，占88．2%。標準菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。主要試劑及儀器:VITEK-AMS菌種鑒定系統(法國生物一梅里埃公司)、M-H瓊脂(杭州天和生物)、ABl7000 PCR擴增儀(美國ABI)、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)、瓊脂糖(美國Bio-Rad公司)。

1．2 藥敏試驗 采用M-H瓊脂，以K-B法進行抗生素敏感性試驗，操作及結果判讀嚴格按照臨床實驗室標準化協會(CLSI-NCCLS)2010年公布的標準進行判斷。

1．3 基因檢測 DNA模板的制備:用加熱裂解法，將過夜培養的細菌置于60 μl、pH 8．0的TE緩沖液(10 mmol/L Tris．Cl和 1 mmol EDTA)中，配成一定濃度的菌懸液，并振蕩混勻。將菌懸液放入97℃水浴中10 min，－20℃放置1 min，12 000 r/min離心5 min后取上清，于－20℃放置備用。

1．4 基因擴增 采用PCR法。根據參考文獻［1，2］設計 int1、int2、int3、sulⅠ基因引物。反應體系:反應體積為 50 μl，Premix Taq PCR 反應液 25 μl，基因模板 2 μl，引物各 1 μl，滅菌蒸餾水 21 μl。整合子基因擴增條件:預變性94℃ 5 min;變性94℃ 30 s，退火55℃30 s，延伸72℃ 60 s;再延伸72℃ 2 min。sulⅠ基因擴增條件:預變性94℃ 5 min;變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 60 s;再延伸72℃ 2 min。取擴增產物10 μl與2 μl的6×上樣緩沖液混勻，點樣于2%瓊脂糖凝膠中，以100 V電壓電泳30 min，紫外檢測儀中觀察結果，凝膠成像系統采集圖像并保存。以出現與陽性對照分子量相同的目的條帶判為陽性。

2 結果

2．1 藥敏試驗 結果見表1。

表1 藥敏試驗結果

2．2 基因檢測結果 7株(13．7%)Ⅰ類整合子陽性，沒有檢測到Ⅱ、Ⅲ類整合子，12株菌(23．5%)sulⅠ陽性。其中有9株耐SXT檢測到sulⅠ基因，6株同時檢測到intⅠ。3株SXT耐藥表型沒有檢測到sulⅠ基因。

3 討論

SMA已經成為非發酵菌中占第3位的細菌，由于它的天然多重耐藥，使得臨床治療相當困難，治療其感染首選藥物為復方磺胺，但是近幾年其對磺胺耐藥呈上升趨勢，耐藥機制的研究也成為熱點。

sulⅠ基因為二氫葉酸合成酶的編碼基因，陽性提示細菌對磺胺類藥物耐受，Barbolla等［3］研究31株SMA，3株表現為對SXT最低抑菌濃度高，經特異引物擴增出sulⅠ基因，同時還檢測到intⅠ基因。Toleman等［4］收集103株臨床分離的SMA，25%的菌株經瓊脂稀釋法檢測到是耐SXT的，26株耐SXT SMA中21株含有 sulⅠ基因，81%存在Ⅰ類整合子上。Correia等［5］對55株SMA研究發現，25株耐SXT的菌株中，17株攜帶sulⅠ基因，而SXT敏感的菌株中沒有sulⅠ基因。以上研究表明sulⅠ基因是SMA對SXT耐藥的主要基因，sulⅠ與Ⅰ類整合子關系密切。

整合子—基因盒系統屬于可移動基因元件，可位于細菌的染色體上，也可借助于移動的質粒、轉座子在同種或不同種細菌之間水平傳播，對細菌耐藥性的傳播產生作用。整合子根據整合酶基因的不同分類，迄今已發現10類整合子，在臨床菌株中常見的為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子，其中尤以Ⅰ類整合子最常見。雖然目前Ⅰ類整合子在SMA中的攜帶率不高，但是整合子機制參與了多重耐藥的水平傳播，因其高效性，應引起足夠的重視，可采取積極有效的措施控制耐藥基因的水平轉移。

本實驗中，sulⅠ基因陽性12株，其中9株表現為SMZ耐藥表型符合率75%，1株SXT耐藥sulⅠ基因陰性可能與其他耐藥機制如泵蛋白、膜通透性等有關。6株SXT耐藥同時檢測到sulⅠ基因與intⅠ基因，表明SXT耐藥與Ⅰ類整合子存在相關，Ⅰ類整合子作為細菌耐藥傳播的重要機制可能將使磺胺類藥物的應用受到一定限制。

［1］周月清，陸開來．鮑氏不動桿菌耐消毒劑——磺胺基因、Ⅰ類整合酶基因及氨基糖苷類修飾酶基因研究［J］．中華醫院感染學雜志，2005，15(7):728-73l．

［2］黃支密，糜祖煌，石曉霞，等．醫院感染革蘭陰性桿菌耐消毒劑基因研究［J］．中華醫院感染學雜志，2005，15(7):721-724．

［3］Barbolla R，Catalano M，Orman BE，et al．ClassⅠ integron increase trimethoprim-sulfamethoxazole MIC，againstepidemiologically unrelated stenotrophomonas maltophiliaisolates［J］．Antimicrob A-gent Chemother，2004，48(2):666．

［4］Toleman MA，Bennett PM，Bennett DM，et al．Global emergence of trimethoprim sulfamethoxazole resistance in Stenotrophomonasmaltophilia mediated by acquisition of sul genes［J］．Emerg Infect Dis，2007，13(2):559-659．

［5］Correia M，Boavida F，Grosso F，et al．Molecular characterization of a new class 3 integron in Klebsiella pneumoniae［J］．Antimicrob Agents Chemother，2003，47(9):2838-2843．