痰液標本結核分支桿菌RNA恒溫擴增檢測及臨床應用

王永忠，張宏宇，劉小琴，朱 珍，柳龍根，張 剛，屠文俊，韋生坤

(常州市第三人民醫院，江蘇常州213001)

目前結核病的實驗室診斷主要包括痰涂片法、培養法、分子生物學方法、免疫學方法等［1］。近年來，以病原體RNA為擴增靶標的核酸恒溫擴增檢測(SAT)技術開始應用于病原體的核酸診斷。我們應用SAT技術對肺結核患者痰液標本中的結核分支桿菌(TB)RNA進行檢測，并與PCR法檢測TB DNA及痰培養、痰涂片抗酸染色直接鏡檢法檢測TB的結果進行了比較。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2010年3月～2011年6月臨床確診為肺結核并接受治療的住院患者131例，男85例、女46例，年齡(49．87 ±17．62)歲;73例非結核性肺部感染患者為同期本院呼吸科住院患者，男45 例、女28 例，年齡(45．71 ±16．9)歲。

1．2 標本采集及保存 痰液標本均為清晨收集，一部分直接做痰涂片抗酸染色，剩余標本取1．5 ml左右于5 ml離心管中，加入1～2倍體積的4%NaOH于無菌樣品管中，旋渦振蕩混勻，室溫放置15～20 min。13 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入1 ml生理鹽水重懸洗滌，13 000 r/min離心5 min，棄上清。處理后標本可直接用于痰培養、SAT、PCR檢測或－80℃凍存。

1．3 SAT檢測 引物及探針序列:TB nT7:5'-gagtggcgaacgggtgagtaac-3'，TB T7:5'-aatttaatacgactcactatagggagacaccaacaagctgataggccgcgg-3'，TB Probe:5'-cgu ccggataggaccacgggacg-3'。RNA提取:液化處理后的痰液標本加入50 μl TB稀釋液重懸后與50 μl陽性對照、50 μl陰性對照一起放入超聲波處理器中進行超聲處理，超聲波功率為300 W，處理時間15 min。超聲處理結束后的產物即可作為檢測反應的模板。反應體系:將試劑平衡到室溫(18～26℃)，充分混勻，按照每個樣品取 28 μl TB 反應液和 2．0 μl TB檢測液計算，配制所需擴增檢測液，振蕩混勻，3 000～4 000 r/min離心10 s備用。擴增檢測:取 2 μl RNA模板加入含30 μl擴增檢測液的微量反應管，置干熱恒溫器上60℃保溫10 min，恒溫混勻儀上42℃保溫5 min，同時將SAT酶液也預熱到42℃;在ABI 7500熒光定量PCR儀上設置恒溫檢測參數，熒光檢測通道設定為FAM;42℃ 1 min，40個循環;熒光信號收集每分鐘進行一次，共檢測40次;向保持于42℃恒溫混勻儀的微量反應管中加入10 μl已預熱的酶液，蓋上管蓋1 200 r/min振蕩15 s混勻，快速轉至ABI 7500實時定量PCR儀，立即啟動反應程序;根據CT值判斷結果。

1．4 PCR檢測TB DNA、痰培養法檢測TB 采用深圳匹基生物和生物梅利埃提供的試劑盒或儀器，并嚴格按說明書操作。痰涂片抗酸染色法嚴格按照中國防癆協會“結核病診斷實驗室檢驗規程”操作，采用齊—尼(Zield-Neehen)抗酸染色法進行痰標本處理、涂片、染色，按照鏡檢300個視野分級報告標準進行。

1．5 統計學方法 采用SPSS17．0統計軟件，結果比較用配對χ2檢驗，靈敏度及特異度等指標比較采用χ2檢驗。P≤0．05為有統計學差異。

2 結果

2．1 不同檢測方法TB陽性檢出率結果比較 131例肺結核患者痰液標本中，SAT法TB陽性檢出率為52．67%(69/131);PCR法陽性檢出率為50．38%(66/131);痰培養法陽性檢出率為39．69%(52/131);痰涂片抗酸染色法陽性檢出率為35．11%(46/131)。經χ2檢驗，SAT法檢出率明顯高于痰培養法(χ2=4．438，P=0．035)和痰涂片法(χ2=8．199，P=0．004)。73例非結核性肺部感染者四種方法均未檢測到痰液標本中TB或其核酸的存在。

2．2 細菌學檢測結果與核酸檢測結果比較 131例肺結核患者痰液標本中，痰涂片及痰培養檢測結果均為陰性的73例，SAT法檢測出15例，PCR法檢測出13例，見表1。

表1 細菌學與核酸檢測結果

2．3 SAT法與PCR法檢測結果比較 用PCR法檢測結果作為參考標準，SAT法靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別是 95．38%、90．91%、91．18%、95．24%。二者符合率為 93．89%。對兩種方法的檢測結果進行配對χ2檢驗，差異無統計學意義(P=0．289)，結果見表 2。

表2 SAT法與PCR法檢測結果

3 討論

世界衛生組織統計數據顯示，全球已有20億人感染了TB，占全球人口三分之一，其中活動性肺結核患者達2 000萬，TB的感染已經成為嚴重的公共衛生問題。建立早期、靈敏、準確、快速的檢測方法對結核病的診斷、治療和防控具有重要意義。

隨著生物技術的快速發展，結核病的實驗室診斷方法已經取得了一定的進展，傳統的痰培養法需要3～8周，改進后的Bactec快速培養系統使培養時間縮短至15 d左右，但該方法只能檢測出活力旺盛的菌，對活力差或死菌則無法檢出［2］;痰涂片法受到標本取材、患者自身間斷性的排菌、標本中菌的數量級大小等多種因素的影響導致其敏感度較低［3］;分子生物學方法在近年的TB檢測中得到了長足發展，其中PCR技術發展較為迅速，它能快速、準確、靈敏地檢出TB DNA，但成本和技術要求較高，易出現假陽性［4］;繼PCR之后，又發展了幾種新的核酸體外擴增技術，如Amplicor PCR、AMTDT等，它們都具有高度的靈敏性和準確性，但Amplicor PCR在操作上仍需進一步自動化以避免手工重復操作，AMTDT法能檢測出無活力菌中的rRNA，不能用于監測化療效果［5］。由于AMTDT不能鑒別 TB和MOTT，也不能進行藥敏試驗，因此不能代替傳統的培養法［6］。

SAT技術具有高靈敏度和高準確性的優點，其技術原理是在同一溫度下，首先通過M-MLV反轉錄酶產生靶標核酸(RNA)的一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產生多個(100～1 000個)RNA拷貝，每一個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環。同時，帶有熒光標記的探針和這些RNA擴增子特異結合，產生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，從而實時反映擴增情況。本研究以SAT的16 s rRNA作為檢測靶標，對131例肺結核患者痰液進行SAT，盡管由于接受結核治療而使病原菌的活力及數量大大減少，SAT法仍能檢出69例陽性痰液，檢出率為52．67%，明顯高于痰培養法的39．69%和痰涂片法的35．1%，非結核性肺部感染者用SAT未檢測到痰液標本中TB核酸的存在，提示SAT應用于TB RNA的檢測具有較高的靈敏度和特異性，可臨床推廣應用。

［1］趙雁林．結核病的實驗室診斷方法［J］．中國社區醫師，2008，24(1):10-11．

［2］王易偉，胡頻頻．rRNA擴增直接檢測結核分枝桿菌的臨床應用價值探討［J］．中華檢驗醫學雜志，2005，28(1):543-544．

［3］李強，陸其斌．影響痰涂片抗酸桿菌檢出率的因素分析［J］．檢驗醫學與臨床，2011，8(1):64-65．

［4］Speers DJ．Clinical applications of molecular biology for infectious diseases［J］．Clin Biochem Rev，2006，27(1):39-51．

［5］Gamboa F，Manterold JM，Vinado B，et al．Direct detection of mycobacterium tuberculosis complex in nonrespiratory specimens by gen-probe amplified mycobacterium tuberculosis direct test［J］．J Clin Microbiol，1997，35(1):307-310．

［6］吳龍章，蔡杏珊，吳幸怡，等．四種檢測方法對結核病臨床診斷價值的探討［J］．中華檢驗醫學雜志，2007，30(7):742-745．