BRMS1基因在胃癌中的表達及意義

韓國新，魏立偉，王慶寶

(泰山醫學院附屬醫院，山東泰安271000)

腫瘤轉移抑制基因是目前腫瘤臨床防治研究的熱點領域之一。國內外學者研究證實，乳腺癌轉移抑制基因(BRMS1)與多種惡性腫瘤的浸潤轉移密切相關。胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，本研究旨在探討BRMS1基因在胃癌中的表達及意義。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2005年1月～2006年11月泰山醫學院附屬醫院住院的胃癌患者44例，男26例、女18例，年齡19～73歲、中位年齡52．3歲。患者術前均未經化療或放療等其他治療。在手術時收集標本，用DEPC處理過的生理鹽水將血液洗凈，立即置于液氮中，24 h后貯存在－80℃冰箱。術后均經病理證實，另取距腫瘤邊緣5 cm以上胃組織(術后病理未發現癌細胞浸潤)作為對照。

1．2 BRMS1的檢測 RNA的提取:取100～200 mg胃癌組織及癌旁正常胃組織分別在不同的研缽中經液氮研磨成粉末狀，轉移至1．5 ml EP管中，提取總RNA(總RNA分離試劑盒，華美生物工程公司);RNA 逆轉錄:體系為:RNA 2 μl、ARP(0．5 μg/μl)1 μl、0．1%DEPC 水 9 μl，輕度離心混勻，70 ℃5 min;0℃ 5 min;冰水中加反應液5×buffer緩沖液5 μl，dNTPs(2．5 mmol)4 μl，RNase 抑制劑 1 μl，M-MLV 逆轉錄酶 2 μl，0．1%DEPC 水 1 μl，反應總體積25 μl，混勻后，37 ℃ 60 min;70 ℃ 10 min;將反應生成的cDNA存于－20℃冰箱備用。PCR反應:以cDNA為模板進行目的基因及內參18 s rRNA產物擴增，注意每組實驗均常規設置復管和陰性對照。目的基因引物及內參引物由大連TAKARA公司設計合成并且經GenBank驗證序列。BRMS1基因特異性引物，上游5'-ATGCCTGTCCAGCCTCCAAG-3';下游 5'-GCGTCGCTCATAGTCCTCATCA-3'，產物長度168 bp。18 s rRNA特異性引物，上游5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3';下游5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'，產物長度151 bp。PCR反應體系:10 × buffer緩沖液 5 μl，MgCl2溶液(25 mmol/L)3 μl，dNTPs(各 2．5 mmol/L)4 μl，上游引物 (10 μmol/L)1 μl，下游引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA 1 μl，rTaq 酶(5 U/μl)0．5 μl，ddH2O 34．5 μl，總體積為50 μl。內參18 s rRNA反應條件:94℃預變性4 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，進行20個循環;72℃延伸4 min。BRMS1基因反應條件如下:95℃預變性4 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行33個循環;72℃延伸4 min。瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像分析系統圖像處理:取10 μl PCR擴增產物與2 μl的6×buffer上樣緩沖液充分混合后，加入凝膠電泳孔中，并用5 μl Mark 2000作為標記，在120 V、50 mA條件下進行電泳。凝膠分析，采用Bio-Rad凝膠成像分析系統進行圖像掃描分析，測定電泳條帶的光密度值。

結果判斷:BRMS1的表達:以看到清晰的條帶作為有表達，記為“+”;沒有表達記為“－”。BRMS1相對表達水平:測定BRMS1 mRNA在胃癌組織及癌旁正常胃組織中表達的光密度值，與同一標本的內參照18 s rRNA電泳條帶的光密度值相比。

1．3 統計學方法 采用SPSS12．0統計軟件，數據比較行χ2檢驗、校正χ2檢驗、Fisher精確概率分析檢驗。P≤0．05為有統計學差異。

2 結果

2．1 BRMS1 mRNA在胃癌組織中的表達 胃癌組織中 BRMS1表達陽性14例，表達量為0．21±0．19，陰性30例;正常胃癌組織分別為35例、0．96±0．21、9例。胃癌組織BRMS1的表達量低于正常胃組織(P ＜0．01)。

2．2 BRMS1 mRNA與胃癌組織臨床病理指標的關系 見表1。

表1 BRMS1 mRNA與胃癌組織臨床病理學指標的關系(例)

3 討論

BRMS1系2000年 Seraj等［1］運用差異顯示分析技術發現的定位于人染色體11q13．1～q13．2的一種腫瘤轉移抑制基因，全長為10 kb，由10個外顯子和9個內含子組成。cDNA全長1 485 bp，有1個741 bp的長開放閱讀框(核苷酸122～862)。編碼1個有264個氨基酸組成的蛋白質，相對分子量為28 500。BRMS1基因在被檢測的酵母、小鼠、人等多個物種及胰腺、胸腺、脾等多種人正常組織中均有不同程度的表達。而且人BRMS1與鼠BRMS1 cDNA 85%同源，蛋白序列同源性達95%，顯示出較高的序列保守性［2］，提示該基因具有重要的生物學功能。

BRMS1抑制腫瘤轉移的機制包括，恢復縫隙連接的細胞間信息交流，促進失巢凋亡，抑制在軟瓊脂中的生長及轉移/侵襲［3］。在分子水平上，當BRMS1重新表達時，可改變轉錄組和蛋白質組，包括表皮生長因子受體、骨橋蛋白、尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)、C-X-C趨化因子受體4和成束蛋白。此外BRMS1也可調控miRNA在內的非編碼基因，可協同調節多個metastamiR的表達［4］。

BRMS1基因對乳腺癌的轉移抑制作用已為大部分學者所共識，一系列研究發現它的轉移抑制作用不只存在于乳腺癌中，而且在惡性黑色素瘤、膀胱癌、卵巢上皮癌、子宮內膜癌、口腔鱗癌、喉癌、小細胞未分化肺癌等多種腫瘤轉移中均起抑制作用，表現為惡性腫瘤伴隨淋巴結轉移的發生，BRMS1 mRNA表達下降或缺失，并且轉染BRMS1的癌細胞株，其轉移潛能明顯降低。本實驗結果顯示，BRMS1 mRNA在胃癌中的表達水平較正常胃組織明顯降低或表達缺失，而且與胃癌的分化程度、浸潤深度和有無淋巴結轉移密切相關，表現為隨胃癌分化程度減低、浸潤深度的增加和淋巴結轉移的發生，BRMS1 mRNA表達下調或缺失。但BRMS1 mRNA表達與患者性別、年齡、胃癌的組織分型無明顯關系。而彭海等認為BRMS1 mRNA的表達下降能夠促進胃癌淋巴結轉移，可以作為臨床預測胃癌轉移的指標之一。同時發現BRMS1 mRNA的表達與胃癌的病理類型和分化程度無關。本研究與此研究結果基本一致，但在與腫瘤的分化程度上存在差異，考慮BRMS1 mRNA具有不同長度的變異剪切體，如果使用不同的PCR引物檢測會產生不同的結果。由此提示BRMS1基因對胃癌的轉移也具有抑制作用，可望成為胃癌轉移的分子生物學標志之一。

［1］Seraj MJ，Samant RS，Verderame MF，et al．Functional evidence for a novel human breast carcinoma metastasis suppressor，BRMS1，encoded at chromosome 11q13［J］．Cancer Res，2000，60(11):2764-2769．

［2］Samant RS，Debies MT，Shevde LA，et al．Identification and characterization of the murina ortholog(brms1)of breast-cancer metastasis suppressor 1(BRMS1)［J］．Int J Cancer，2002，97(1):15-20．

［3］Edmonds MD，Hurst DR，Welch DR．Linking metastasis suppression with metastamiR regulation［J］．Cell Cycle，2009，8(17):2673-2675．

［4］Edmonds MD，Hurst DR，Vaidya KS，et al．Breast cancer metastasis suppressor 1 coordinately regulates metastasis-associated microRNA expression［J］．Int J Cancer，2009，125(8):1778-1785．