水稻秸稈木質纖維素水解物中糖的測定方法比較

張 薇,姚 青,王明遠,蘇小軍,熊興耀

(1湖南農業大學理學院,長沙 410128;2湖南輕工業研究所,長沙 410002;3湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室,長沙 410128)

水稻秸稈木質纖維素經輻照加酶處理轉化的糖組成很復雜,已知的成分由木糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、麥芽糖、纖維二糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等組成。其中糖的種類與含量是將其發酵成燃料乙醇的參考指標[1～6]。目前,有關其糖的測定方法有很多,常用的方法有滴定法、旋光法、薄層法、液相色譜法、氣相色譜法、氣質聯用法、毛細管電泳法、離子色譜法等[7～9]。本文比較了采用液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法、離子色譜法分離測定木糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、麥芽糖、纖維二糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等組成的混合物。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

葡萄糖 (AR)、木糖 (GR)、果糖 (AR)、鼠李糖(GR)、半乳糖 (AR)、麥芽糖 (AR)、葡萄糖醛酸 (AR)、半乳糖醛酸(AR)、纖維二糖 (AR)、蔗糖 (AR)、乳糖(AR)等購于天津基準化學試劑有限公司;纖維素酶購于湖南鴻鷹祥生物工程公司;實驗所用水都為超純水。

1.2 實驗儀器

離子色譜儀 ICS-3000,美國戴安公司;HP5890氣相色譜儀;Agilent HPLC1200液相色譜儀;Beckman P/AGETMMDQ(Beckman公司 )。

2 實驗方法

2.1 標準溶液的配制

混合糖溶液 A:精確稱取葡萄糖、果糖各 0.0450 g,蔗糖、麥芽糖各 0.0900 g于容量瓶中,用超純水定容至25 mL,即為 10 mmol/L混合工作對照糖溶液。

混合糖溶液 B:蔗糖、麥芽糖、乳糖各 0.0900 g,葡萄糖0.0450 g于容量瓶中,用超純水定容至25 mL,即為 10 mmol/L混合工作對照糖溶液。

緩沖液:精密稱取吲哚-3-乙酸 0.0175 g,磷酸鈉0.0950 g,加入適量超純水,緩慢滴加 1 mmol/L氫氧化鈉,同時攪拌控制 pH值在 11.0以下至吲哚-3-乙酸完全溶解,定容至 50 m L,4℃冰箱備用。

標準溶液:準確稱取葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、果糖、纖維二糖、麥芽糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸各 0.0500 g于容量瓶中,用超純水定容至 10 mL,搖勻,再取其中1.00 mL到10 mL容量瓶中,以超純水稀釋至刻度線,搖勻配成 5 mg/L的 9種混合糖標準溶液。

2.2 氣相色譜法測定條件

儀器:SP6890氣相色譜儀。檢測器:FID。分析柱:Agilent HP-1 30 m×0.25 mm×0.25μ m。 載氣:N2:40 m L/min,H2:40 mL/min,Air:400 mL/min。柱溫:230℃,進樣口溫度 280℃,檢測溫度 300℃。

2.3 高效液相色譜法測定條件

儀器:Agilent HPLC1200液相色譜儀。檢測器:ELSB-3300(蒸發光散色檢測器),要求流動相不含不揮發鹽。色譜柱類型尺寸:ZORBAX Eclipse XPB-C18 4.6 mm×250 mm。流動相:乙腈 /水63%/37%。柱溫:35℃。 氣體流速:1.5 L/min,檢測溫度 50℃。

2.4 毛細管電泳法測定條件

儀器:Beckman P/AGETMMDQ,二極管矩陣檢測器,Beckman System Gold軟件,320-pH計。

2.5 離子色譜法測定條件

戴安離子色譜儀 ICS-3000,安培檢測器。波形:糖四電位波形。色譜柱類型尺寸:CarboPac PA20分析柱,150 mm× 3 mm,CarboPac PA20保護柱,50 mm×3 mm。電極:Au電極,Ag-AgCl參比電極。淋洗液組成及流速:NaOH/NaOAc,梯度:0～15 min,NaOH 10 mM;25～ 33 min,NaOH 100 mM;35～ 50 min,NaOH 100 mM,NaOAc 120 mM;50.1～ 55 min,NaOH 200 mM;55.1～65 min,NaOH 10 mM 0.48 m L/min。柱溫:30℃。進樣體積:25μ L。進樣方式:自動進樣。

3 結 果

3.1 氣相色譜法結果

取0.2 mL的標準溶液于20 mL的黑塞管中,加入2 mL硼氫化鈉 /二甲亞砜 (2 g/100 mL)溶液,放于40℃水浴90 min。取出加入0.2 mL冰醋酸終止反應,加入 2 mL醋酸酐,0.2 mL1-甲基吲哚反應 10 min,加10 m L雙蒸水,然后加入 1 mL二氯甲烷,搖 1 min,靜置分層,取出二氯甲烷層,于-20℃冰箱中,待上氣相色譜分析。

結果表明,氣相色譜法是測單糖的較好方法,但二糖不好氣化不好測。

3.2 高效液相色譜法結果

取20 m L的標準溶液于20 mL的容量瓶中,過濾,進樣20μL,在上述色譜條件下進行 HPLC分析。

結果表明,高效液相色譜法定量上有優勢,進樣量能控制,但分離效果不理想。

3.3 毛細管電泳法結果

在電壓 29 kV,毛細管內徑 50μ m,樣品槽溫度25℃,毛細管溫度25℃,緩沖體系pH12.31條件下對混合糖溶液 A、混合糖溶液 B進行分離。檢測波長 254 nm。

由于在 pH12.31條件下混合糖 B不能完全分離,對pH條件進行進一步摸索。

以 1 mmol/L氫氧化鈉調節緩沖液至 pH12.25,pH12.31,pH12.36,pH12.40,pH12.46,用 0.22 μ m的水膜過濾后對混合糖溶液 B進行電泳分析。

緩沖液 pH12.31條件下,混合糖溶液 A分離圖譜如圖 1。緩沖液 pH12.31條件下,混合糖溶液B分離圖譜如圖 2。

在這一條件下雖然大部分糖類可較好分離但仍有部分重合現象,特別是麥芽糖和葡萄糖這兩個稻稈木質纖維素水解液中常會出現的糖無法分離。

圖1 混合糖磷酸緩沖體系分離圖譜Fig.1 Seperation of sugars in phosphate buffer

緩沖體系 pH改變實驗中,直到 pH達到 12.46,混合糖溶液B中的各種糖才得到完全分離,圖譜如圖 3。

圖2 磷酸緩沖體系pH12.31下蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖分離圖譜Fig.2 Seperation of sugars in phosphate buffer(pH12.31)

比較圖 2、圖 3可以看出,適當提高 pH值至pH12.46分離效果有所改善,但是其峰對稱性差等問題仍無法解決,而且分離過程中電流明顯加大。

圖3 磷酸緩沖體系pH12.46下蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖分離圖譜Fig.3 Seperation of sugars in phosphate buffer(pH12.46)

3.4 離子色譜法結果

取標準溶液,經過 0.22μ m尼龍濾膜和OnGuard II RP柱(2.5 cc,經甲醇和水活化),棄去初始 6 mL后收集1 mL流出液,在NaOH/NaOAc梯度程序直接進樣分析。結果見圖 4。

圖4 標準溶液的離子色譜圖Fig.4 The chromatogram of 9kinds of sugar 5mg/L mixed standard solution

離子色譜法結果表明,在同一根色譜柱 (如CarboPac PA20)、同一個梯度程序中,可同時檢測單糖、二糖等,分離效率高。

4 結 論

目前對糖類化合物定性定量的測定方法,主要有氣相色譜法、液相色譜法、毛細管電泳法、離子色譜法等,這些方法在測定低含量的糖類化合物時,除離子色譜法外,需對樣品進行柱前衍生或柱后衍生,操作步驟繁瑣,所需時間較長,人力和物力成本較高。氣相色譜法是測單糖的較好方法,但二糖不好氣化不好測。高效液相色譜法定量上有優勢,進樣量能控制,但分離效果不理想。毛細管電泳法具靈敏度高、選擇性好、分離效率高等特點,但需對樣品進行柱前衍生。而離子色譜法使用了脈沖安培檢測器,這種檢測器可對糖類化合物直接進行檢測,無需衍生,可直接進樣,樣品處理方法非常簡單,安培檢測法具有非常高的靈敏度,且具有選擇性,可同時檢測多種糖,在測定中,同時分離了鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、纖維二糖、麥芽糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸,幾種糖之間的分離度均大于1.5,實現了基線分離,本方法對于糖的檢測限可低至pmol水平。故毛細管電泳法、離子色譜法可用于稻稈木質纖維素水解液中糖組分的分離測定。

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