多重分離-光譜法測(cè)定飼料中尿素含量

吳豫鄂

(武漢工程大學(xué)分析測(cè)試中心,湖北 武漢 430074)

0 引 言

飼料中添加適量的尿素可以補(bǔ)充動(dòng)物生長(zhǎng)所需的氮，降低飼養(yǎng)成本，然而過(guò)量會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡[1].飼料中過(guò)量添加尿素對(duì)畜牧業(yè)的危害是不容忽視的，對(duì)飼料中尿素含量進(jìn)行監(jiān)控很有必要，但目前我國(guó)尚無(wú)相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn).因此，探索飼料中尿素的定量檢測(cè)方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值.

尿素的測(cè)定方法有多種，但由于基體物質(zhì)的干擾都不能直接用于飼料中尿素含量的測(cè)定.本研究采用吸附、沉淀與共沉淀的多重分離法對(duì)干擾物質(zhì)與尿素進(jìn)行分離，通過(guò)優(yōu)化分離條件使分離率達(dá)到90%以上.用對(duì)二甲氨基苯甲醛光度法對(duì)分離樣液中的尿素進(jìn)行定量測(cè)定[2- 3]，準(zhǔn)確地檢測(cè)出了飼料中尿素的含量.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器

德國(guó)天平METTLFTR TOLEDO AB104-S/FACT；美國(guó)惠普紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)HP-8452A；德國(guó)超純水系統(tǒng)Sartorius stedim arium?611UV；上海電熱恒溫箱DHG-9070A.

1．2 試劑

尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液；對(duì)二甲氨基苯甲醛(DMAB)溶液；磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)；亞鐵氰化鉀溶液；乙酸鋅溶液；活性碳；市售飼料.

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 干擾物質(zhì)的分離 稱取預(yù)先粉碎至篩分0.85 mm以下的樣品1～2 g(精確到0.1 mg)至100 mL小燒杯中，加入1 g活性碳，加水25 mL，迅速加入5 mL乙酸鋅溶液，攪拌2 min，再加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液，攪拌5 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的乙酸將pH值調(diào)到5左右，40～50 ℃保溫放置2 h.用定量濾紙過(guò)濾，水洗，洗濾液承接于100 mL容量瓶中，定容.同時(shí)做試劑空白試驗(yàn).

1．3．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取1 mg·mL-1或0.2 mg·mL-1的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液(視樣品中尿素含量而定)0、1、2、3、4、5 mL于25 mL具塞比色管中，加入5 mL磷酸鹽緩沖液，加水至約15 mL，加入5 mL DMAB顯色液，用水稀釋至刻度，搖勻，15～35 ℃放置20 min，在420 nm波長(zhǎng)下，用1 cm或3 cm比色池測(cè)定，以吸光度為縱坐標(biāo)，尿素含量為橫坐標(biāo)作曲線圖.

1.3.3 尿素含量的測(cè)定 取樣品濾液5～15 mL加入25 mL具塞比色管中，其他步驟同1.3.2，查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算尿素含量.

2 結(jié)果與討論

2．1 乙酸鋅、亞鐵氰化鉀對(duì)有機(jī)干擾物的分離效果

本研究用乙酸鋅作沉淀劑分離樣品溶液中的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸[4]；用亞鐵氰化鉀與過(guò)量的乙酸鋅反應(yīng)生成膠性氰亞鐵酸鋅沉淀[5]，此膠性沉淀既可去除過(guò)量的乙酸鋅，又有共沉淀蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸絡(luò)合物的作用，還能吸附沉淀微粒使濾液澄清透明.分離效果見(jiàn)圖1.

圖1 分離效果比較圖

圖1是不含尿素的飼料樣品經(jīng)不同處理所得濾液的紫外-可見(jiàn)光譜掃描圖.a是飼料水溶液濾液的掃描圖，b是飼料經(jīng)活性碳處理后濾液的掃描圖，c是飼料經(jīng)活性碳、乙酸鋅和亞鐵氰化鉀處理后濾液的掃描圖.a處理得到的濾液有較深的黃色，在210～420 nm之間有很強(qiáng)的吸收,說(shuō)明其中含有豐富的有機(jī)物.b處理得到無(wú)色略帶混濁的濾液，在420 nm的吸收接近于零，在300 nm附近有很強(qiáng)的吸收，加入DMAB后在420 nm處的吸收顯著高于試劑空白.說(shuō)明此處理對(duì)色素的分離效果很好，分離蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等物質(zhì)的效果較差.c處理得到無(wú)色透明的濾液，在420 nm的吸收接近于零, 在300 nm附近有微弱的吸收，加入DMAB后在420 nm處的吸收與試劑空白無(wú)明顯差異.說(shuō)明該處理對(duì)色素、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等有機(jī)物質(zhì)有很好的分離效果.

2．2 活性碳的脫色效果及使用粒度、使用量的選擇

活性碳是良好的吸附劑，對(duì)非極性和弱極性有機(jī)物有較強(qiáng)吸附力，脫色效果很好[6]，見(jiàn)圖1.活性炭顆粒的大小，對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響.粒度大，與溶液中的色素分子的接觸的表面積相對(duì)較小，吸附效果欠佳；粒度小，過(guò)濾時(shí)間較長(zhǎng)；當(dāng)粒徑過(guò)小時(shí)，會(huì)發(fā)生活性炭微粒的穿濾，穿濾的微粒在420 nm有吸收，對(duì)光度分析產(chǎn)生干擾，所以選用0.25～0.15 mm粒徑的活性炭.

從理論上講，隨著活性炭用量增加脫色效果會(huì)增強(qiáng)，但是活性炭的用量過(guò)大會(huì)造成洗濾困難，在對(duì)洗濾體積有一定要求的情況下，樣品中的尿素不能被完全洗出，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低.經(jīng)實(shí)驗(yàn)，稱取2 g樣品加入1 g活性炭能得到滿意的效果.

2．3 溫度對(duì)吸附分離色素的影響

溫度對(duì)吸附效果有顯著影響[7].

用色值測(cè)定計(jì)算吸附分離色素的效果(脫色率)：以去離子水為背景，420 nm下，1 cm的比色杯測(cè)定吸光度.

按1.3.1方法，在不同溫度下制取樣品脫色液，測(cè)定濾液的色值并轉(zhuǎn)換成脫色率.溫度對(duì)脫色效果的影響見(jiàn)圖2.

由圖2可見(jiàn)，脫色率與溫度成正相關(guān)，超過(guò)50 ℃變化趨緩.考慮到40～50 ℃時(shí)的脫色率已滿足實(shí)驗(yàn)要求，且溫度過(guò)高會(huì)使尿素水解，選擇40～50 ℃為最佳溫度.

圖2 溫度對(duì)脫色效果的影響

2．4 時(shí)間對(duì)分離效果的影響

吸附反應(yīng)達(dá)到平衡需要時(shí)間，沉淀與共沉淀完成生成、陳化、沉降的過(guò)程也需要時(shí)間，時(shí)間對(duì)分離效果有較大的影響[7].實(shí)驗(yàn)表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)脫色效果顯著變好，但2 h以后變化趨緩，選擇2 h的分離時(shí)間既能取得良好的分離效果，又能相對(duì)提高分離效率，見(jiàn)圖3.

圖3 時(shí)間對(duì)脫色效果的影響

2．5 pH值對(duì)吸附分離色素的影響

用1.3.1方法制備6份實(shí)驗(yàn)樣品，將其調(diào)節(jié)到不同的pH值，測(cè)定濾液的色值并轉(zhuǎn)換成脫色率.實(shí)驗(yàn)表明，脫色率隨著pH增大而降低，pH4～5時(shí)脫色率達(dá)90%以上，能滿足實(shí)驗(yàn)要求，見(jiàn)圖4.選擇pH4～5為最佳酸度.

圖4 pH值對(duì)脫色效果的影響

2．6 其它非蛋白含氮物質(zhì)對(duì)測(cè)定干擾的研究

除尿素以外，硫酸銨、三聚氰胺、縮二脲也可能被加入到飼料中充作氮源.實(shí)驗(yàn)表明，這些物質(zhì)不與DMAB發(fā)生顯色反應(yīng)，對(duì)測(cè)定尿素不產(chǎn)生干擾，見(jiàn)圖5.

圖5 幾種物質(zhì)與DMAB顯色后的紫光可見(jiàn)光譜圖

圖5是硫酸銨、三聚氰胺、縮二脲等加入DMAB顯色后的紫外-可見(jiàn)光譜掃描圖.曲線B是5 mL DMAB顯色劑的試劑空白掃描圖；曲線V1是200 μɡ·mL-1硫酸銨加入5 mL DMAB顯色后的掃描圖；曲線E1是200 μɡ·mL-1縮二脲加入5 mL DMAB顯色后的掃描圖；曲線F1是200 μɡ·mL-1三聚氰胺加入5 mL DMAB顯色后的掃描圖；曲線I1是200 μɡ·mL-1尿素加入5 mL DMAB顯色后的掃描圖.由圖5可見(jiàn)，420～470 nm處硫酸銨、縮二脲、三聚氰胺與DMAB試劑空白的吸收?qǐng)D形沒(méi)有區(qū)別，而尿素在此處有明顯的吸收.在420 nm處，DMAB試劑空白、硫酸銨、縮二脲、三聚氰胺、尿素加入DMAB顯色后的吸光度分別是0.343，0.345，0.350，0.355，0.853，扣除試劑空白后硫酸銨、縮二脲、三聚氰胺沒(méi)有吸收，尿素有0.51吸光度的吸收.

2．7 適合測(cè)定的含量范圍

對(duì)二甲氨基苯甲醛光度法測(cè)定尿素線性相關(guān)性好，靈敏度不高.實(shí)驗(yàn)的回歸曲線為y=0.112 9x+0.001 1,相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，40 μg·mL-1尿素的吸光度為0.113.考慮到稱樣量和分取體積等因素，建議本法適用于尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.2%以上的飼料產(chǎn)品.

2．8 實(shí)驗(yàn)中須注意的問(wèn)題

飼料原材料豆粕中含有尿素酶，遇水會(huì)使尿素分解.因此當(dāng)樣品加入活性碳和水后，要迅速加入乙酸鋅，使尿素酶沉淀失活，以免樣品中的尿素被分解.

2．9 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性

取100 g不含尿素的飼料，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99.0%的分析純尿素2 g，充分混均，用1.2所述方法進(jìn)行重復(fù)測(cè)定.尿素的平均回收率達(dá)到99.9%，實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性良好，RSD為3.0%，見(jiàn)表1.

表1 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 語(yǔ)

用活性碳吸附色素，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀共沉淀蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸，此多重分離的方法可以使飼料中的尿素與復(fù)雜的基體物質(zhì)得到良好的分離.樣品中加入分離劑后，在pH5左右的酸性條件下，于40～50 ℃靜置2 h，用水淋洗分離，分離效果能達(dá)到90%以上.用對(duì)二甲氨基苯甲醛光度法對(duì)分離后的樣液中的尿素進(jìn)行定量分析，回收率可達(dá)到99.9%，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的RSD為3.0%.

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