小麥抗條銹品種遺傳多樣性的SSR分析

劉文濤, 程登發, 康曉慧, 孫京瑞, 張云慧,羅宵鳳, 張 梅, 張 利, 張 娜

(1.中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193;2.西南科技大學生命科學與工程學院,綿陽 621010)

小麥抗條銹育種親本遺傳基礎的狹窄會導致育成品種對條銹菌新小種抵抗能力的下降[1],而目前各國小麥育成品種所選親本多數都集中在少數幾種精英材料上,如此一來造成了育成小麥品種遺傳基礎的狹窄。所以利用物種內、品種間的遺傳多樣性,并選擇親緣關系較遠的抗病種質作為雜交的親本,是培育小麥抗條銹新品種的一種有效方法[2]。

小麥的SSR標記已有報道,本研究應用大量已報道的小麥SSR標記并從中篩選出條帶清晰且多態性好的標記用于分析我國幾大小麥產區主栽品種中抗銹品種的遺傳多樣性,為小麥抗條銹育種親本材料的選擇提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

參試的小麥品種為幾大小麥產區的主栽品種,共219個,‘銘賢169’作為感病對照,種子均為中國農業科學院植物保護研究所提供。供試菌種為當前條銹菌優勢小種和致病類型[3]：Su-4、CYR33和CYR32的混合菌,由甘肅省農業科學院植物保護研究所提供。

所用引物的序列來自 R?dert等[4]和 Gup ta等[5]發表的小麥微衛星引物序列,按照擴增條帶清晰、多態性好、在染色體上分布均勻的原則篩選到27對SSR引物,用于小麥抗銹品種的聚類分析。引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。

1.2 方法

1.2.1 條銹病抗性鑒定

將參試小麥品種播種于四川綿陽河西村的中國農科院植保所試驗基點,成株期進行接菌處理[6],待感病對照充分發病(反應型4級、嚴重度90%、普遍率達95%)時,一次性記錄完畢所有參試品種的反應型 ,反應型為0、0;、1、2 的為抗病品種,分別對應為免疫、近免疫、高抗、中抗;反應型為 3～4的為感病品種,分別對應為中感和高感[7]。對表現抗病的品種進行后續的試驗。

1.2.2 基因組DNA的提取

用Saghai-Maroof等[8]的CTAB法提取小麥幼苗葉片的DNA。提取之后分別用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測提取 DNA的完整性和濃度、純度,并將 DNA樣品濃度稀釋到 50 ng/μL,4℃保存備用。

1.2.3 SSR-PCR擴增

PCR反應體系的體積為20μL,包括：2×PCR mix 10 μL,引物 1 μmol/L 2 μL(左、右引物各1μL),模板 DNA 50 ng/μL 2μL,ddH2O 6 μL;2×PCR mix主要成分包括：Taq DNA聚和酶(recombinant)：0.05 units/μL;MgCl2：4 mMol/L;dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)：0.4 mmol/L;染料。

PCR擴增程序：首先94℃預變性5 min;然后94℃變性1 min,退火(依據不同引物退火溫度不同)1 min,于72 ℃延伸1min,共30個循環;最后在72℃延伸5Min。6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染顯色。

1.2.4 PCR擴增產物的檢測

PCR擴增結束后,向反應管中加入5μL的上樣緩沖液,94℃下變性5min后馬上放到碎冰中降溫備用。6%變性聚丙烯酰胺凝膠上點樣,恒功率60W下電泳1.5～2 h,銀染檢測擴增的情況。

1.2.5 抗銹品種的聚類分析

根據樣品在SSR位點上不同等位變異在凝膠上的條帶有無,建立0-1矩陣(有帶為1,無帶為0),應用NTSYSpc 2.10軟件計算品種間的遺傳相似系數,按UPGMA進行遺傳相似性聚類分析。各引物的PIC按下述公式計算：PIC=1-∑P2ij,其中 Pij為第i個SSR位點第j個等位變異在全部抗銹材料中出現的頻率。利用NTSYSpc 2.10軟件計算品種間遺傳相似系數(GS)和遺傳距離(GD=1-GS),用UPGMA進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 條銹病抗性鑒定

成株期進行接菌處理后,待感病對照充分發病時,調查219個參試品種的反應型所得的結果是,抗病品種有39個,見表1,其余均表現為中感或高感。

表1 篩選出的小麥抗銹品種

2.2 引物的多態性信息指數分析

采用27對SSR引物對40份(包括對照‘銘賢169’)小麥品種進行擴增,共擴增到104個等位變異,平均每個SSR位點為3.85個。引物的PIC在0.210～0.712之間,平均為0.455,通過PIC可以了解到每個SSR位點附近小麥基因組的變異程度,PIC指數越大則變異程度越高,見表2。

表2 27對SSR引物的多態性信息指數(PIC)

2.3 抗銹品種的遺傳相似系數分析

在39份抗銹品種中,‘綿麥42’與‘蘭天20號’之間的遺傳相似系數最低,為0.250;‘陜麥 139’與‘小偃 216’之間的遺傳相似系數最高,為 0.896,所有品種之間的遺傳相似系數平均為0.723。參試材料中抗銹品種的遺傳相似系數主要分布在0.67～0.76區段之間。

2.4 抗銹材料的聚類分析結果

通過分析抗銹材料的聚類圖(圖1)可以得到,40份材料(包括對照)在DICE距離1.345處可分為4個類群。第I類群包括24份材料,占全部材料的60%,第I類群在1.233處又可分為4個亞群。I-1有16個品種,在1.175處I-1亞群又可以分為2個小群。I-1-1有7個品種,此7個品種中有4個品種是春性小麥,同時也都是早熟至中早熟品種,它們分別是：‘綿麥37’、‘綿麥39’、‘綿麥 185’和‘西科麥 4 號’,其中‘綿麥39’、‘綿麥185’和‘西科麥 4號’都含有‘綿陽96’的譜系;另3個品種有2個是‘西農88’和‘西農889’,這兩個品種都是由西北農林科技大學培育成功的,它們都屬于半冬性品種;I-1-1中還有一品種為‘蘭天15號’,它屬于冬性、中熟品種。I-1-2中有9個品種,這個類群比較雜,但也以半冬性品種為多,其中半冬性品種‘周麥22’和‘洛麥21’都是以‘周麥13’作為父本培育成的。I-2有2個品種：‘新麥19’和感病對照‘銘賢169’。I-3有5個品種,此5個品種均是半冬性、中熟品種,其中‘西農3517’和‘西農2595’的系譜當中均含有‘西農 1376’的譜系。I-4只有 1個品種：‘蘭天17’。第Ⅱ類群包括5個品種,這5個品種有2個是半春性品種,有3個是半冬性品種,其中半冬性品種‘陜麥139’和‘小偃216’都含有‘小偃22’的系譜。第Ⅲ類群僅有1個品種：‘綿麥 1403’,屬半春性、早中熟品種。第Ⅳ類群包括10份材料,在1.273處可分為2個亞群,Ⅳ-1包括 7份材料,除 1份材料屬半春性(XK 0106-108D6)外,其余6個品種均屬冬性或半冬性。Ⅳ-2包括3個品種,均是冬性、早中熟至中熟的小麥品種。

3 小結與討論

篩選出的39份小麥抗銹材料集中在綿麥系、蘭天麥系和陜麥系3個麥系,而其他的供試材料絕大多數表現感銹,此39份小麥抗銹材料之間遺傳關系較近,27對SSR引物僅擴出104個等位變異,平均每對引物為3.85個。抗銹品種的聚類結果顯示,并不是所有育種單位相同和血緣相近的品種都聚到了一起,也并不是所有生育期相似的品種都聚到了一起,如‘綿麥 39’和‘綿麥 1403’,都是在四川綿陽培育成的品種,都含有‘貴農21-1’的血緣,且前者是春性小麥中早熟品種,后者是半春性早中熟品種,前者卻被聚到了I-1-1亞群,后者被聚到了第Ⅲ類群。這從側面反映出此39份抗銹材料的親緣較近,或者是采用的SSR位點與重要育種性狀的連鎖不緊密造成的。其余抗銹品種的聚類結果大多數符合血緣相近、生育期相似及育成地相同的原則。

本試驗從219個小麥主栽品種中篩選出了39個抗銹品種,一類是由我國不同育成地的品種分別做父本和母本而培育出的抗銹品種,如‘洛麥 21號’,它是由‘洛麥 1號’做母本、‘周麥13’做父本雜交并通過系譜法選育而得到的抗銹品種,此次試驗成株期抗銹性表現為中抗;類似的品種還有‘綿麥42’,它是由‘綿陽96-5’和‘貴農21-1’雜交系譜選育法培育出的品種,該品種已在綿陽地區推廣數年,歷年的抗銹表現均為高抗或近免疫,屬于這一類的品種還有 ：‘新麥 19’、‘綿麥 39’、‘綿麥 185’、‘新麥18’、‘矮抗58’等。還有一類,是由國際抗銹品種與我國主栽品種雜交出的抗性品種,如‘蘭天22號’,它是由‘德國2號’和‘蘭天11號’雜交系譜選育法培育出的品種,在我國推廣多年抗銹性一直表現穩定而良好,屬于這一類的品種還有：‘綿麥 37’、‘蘭天 15號’、‘蘭天20號’、‘西農 88’、‘陜627’等。目前培育出的抗銹品種的血緣多數都是集中在少數幾個著名的國際材料上[9],致使多數抗銹材料血緣較為接近,如此一來會導致抗銹小麥品種遺傳多樣性的銳減,這提示我們培育小麥抗銹新品種應針對不同地理位置采用不同的育種手法、制定不同的育種目標,不要集中在少數幾個著名的抗銹材料上。試驗中篩選出的抗銹品種均包括我國小麥產區的主栽品種的血緣,類似于這樣的抗銹品種的出現不僅填補了當前我國小麥抗銹材料的空白,相比血緣集中在少數幾個國際抗銹材料上的品種而言,更增加了小麥抗銹材料的遺傳多樣性,對防治小麥條銹病的流行大有裨益。

圖1 40個小麥抗銹品種的聚類圖(品種編號與表1相同)

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