山西省棗樹上啤酒花矮化類病毒的檢測及序列分析

張本利, 李世訪

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,長春 130000; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

類病毒是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小病原物,1971年美國研究人員Diener在研究馬鈴薯紡錘塊莖病的過程中,提出了“類病毒”的概念[1],它是一類單鏈共價閉合環(huán)狀的裸露RNA分子,由246～475個核苷酸組成,具有自我復制能力,是感染某些高等植物的低分子致病性因子[2]。

啤酒花矮化類病毒(Hop stuntviroid簡稱HSVd),屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科啤酒花矮化類病毒屬。1970年,日本的Yamamoto等人首次在矮化的啤酒花上發(fā)現(xiàn)了啤酒花矮化類病毒[3]。該類病毒在某些寄主如葡萄和杏上呈潛伏侵染,而在某些寄主上卻會造成嚴重病害,如啤酒花矮化病[4]、李和桃斑果病[5]、柑橘矮化和裂皮病[6-7]等。HSVd侵染寄主植物后是否有癥狀表現(xiàn),且癥狀表現(xiàn)是否與地域、品種等有關(guān)還有待進一步的研究。1997年,Kofalvi等從李屬植物上獲得新的HSVd序列后,將HSV d分為 5個類型[8]：李型、啤酒花型、柑橘型、李-柑橘型和李-啤酒花-柑橘型。

1985年,日本的Sano首次在葡萄上發(fā)現(xiàn)了HSV d,經(jīng)過15年的研究,認為HSVd的初侵染源為葡萄,在進化過程中逐漸適應了新的寄主[9]。目前國內(nèi)外已報道的HSV d寄主包括黃瓜、葡萄、桃、李、扁桃、杏等草本及木本植物。中國已經(jīng)在啤酒花[10]、桃[11]、李[12]、杏[13]、葡萄[14]、扁桃[15]等植物上報道了HSV d。目前為止,國外還沒有在棗樹上發(fā)現(xiàn)任何類病毒,本研究首次在國內(nèi)報道了棗樹上檢測出的啤酒花矮化類病毒及其序列特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

供試棗樹葉片樣品采自山西省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所國家棗種質(zhì)資源圃,共計70份。

1.1.2 主要試劑

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和 2×Taq PCR MasterMix購自北京天根生化科技有限公司,限制性內(nèi)切酶Sma I購自 TaKaRa公司;T4 DNA連接酶、T7 RNA聚合酶、NTPs等購自 Promega公司;質(zhì)粒小提和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購于Qiagen公司;DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7),CSPD化學發(fā)光底物,DIG Easy H yb購自Roche公司;H ybond-N+購自Amersham公司;其他化學試劑等均為市售。

1.1.3 載體及受體菌

pGEM-T Vector購自Promega公司;大腸桿菌(Escherichia coli)DH 5α購于北京天根生化科技有限公司。

1.1.4 引物

HSV d引物參考GenBank中登錄的(登錄號：D13764)核苷酸序列,設(shè)計了3條引物(表1),其中HSV d P1用于RT,HSVd P2和HSVd P3用于PCR,下劃線的部分為SMa I酶切位點。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 HSVd的引物序列及相關(guān)信息

1.2 試驗方法

1.2.1 類病毒RNA提取

參考Li等報道的方法[10],取葉片樣品5 g,提取后溶于20μL dd H2O中,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Northern雜交

1.2.2.1 探針制備

(1)在DMPC處理并高壓滅菌的無RNase污染的微型離心管中依次加入下列反應物：線性化模板DNA 4μL(1μg),10×NTP標記混合物 2μL,10×轉(zhuǎn)錄緩沖液2μL,DEPC-H2O 10μL,T7 RNA聚合酶 2μL,輕輕混勻反應物,37℃保溫反應至少2 h;

(2)向反應體系中加入2μL無 RNase污染的DNase I,37℃下再保溫反應15 min;

(3)向反應體系中加入2μL(200 mmol/L)的EDTA終止轉(zhuǎn)錄反應;

(4)再向反應體系加入2.5μL(4 mol/L)LiCl和75μL冰冷100%乙醇,4℃下沉淀過夜;

(5)4℃下,12 000 r/Min離心15 min,沉淀用70%冷乙醇洗滌一次,真空干燥;

(6)沉淀按1μg/10μL的濃度重懸于DEPCH2O中,檢測并分裝后置于-70℃保存。

1.2.2.2 CG的致病力測定

將Hybond-N+尼龍膜平鋪在凝膠上,然后鋪上3張3 mMWhatman濾紙并用玻璃板夾緊過夜。小心取下轉(zhuǎn)移膜,將其自然晾干后,于120℃烤膜30min或者80℃烤膜2 h。

1.2.2.3 雜交

將處理好的尼龍膜裝入雜交瓶,按照10 ML/100 cm2的比例加入雜交緩沖液(DIG Easy Hyb),68℃預雜30min;68℃雜交6 h以上,棄雜交液,用2×SSC,0.1%SDS和0.5×SSC,0.1%SDS洗膜,各2次,每次15 min,1%封閉液封閉30 min,加入Anti-DIG-AP抗體37℃反應1 h后用洗滌緩沖液洗2次,每次 15 min,檢測液平衡 5 Min;滴加CSPD,使CSPD在膜上擴散均勻,室溫放置10min;將多余的CSPD液體擠凈并封口,37℃處理10 min;在暗室曝光后取出膠片顯影、定影。

1.2.3 RT-PCR擴增

1.2.3.1 反轉(zhuǎn)錄

取1.5 ML離心管加入3μL核酸提取液,4μL 5×M-MLV buffer,4 μL(2.5 mmol/L)dNTPs,1μL(40 U/μL)RNasin,1μL(20μMol/L)引物HSV d P1,1 μL(200 U/μL)M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶,加dd H2O至20μL,室溫下放置10 min,42℃反應1 h后,快速移至冰上放置2Min后貯存于-20℃冰箱中備用。

1.2.3.2 PCR擴增

PCR體系為：2×Taq PCRMaster Mix 25μL,引物對HSV d P2、P3各 1μL(20μmol/L),反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3μL,dd H 2O 20μL。PCR程序為：94℃預變性4min,94℃變性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個循環(huán),72℃延伸7Min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收,克隆及序列分析

1.2.4.1 PCR產(chǎn)物的回收

將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下切割特異性條帶,分別裝入1.5ML離心管中,使用Axygen PCR產(chǎn)物回收試劑盒進行回收。

1.2.4.2 克隆及序列分析

連接反應按照pGEM-T試劑盒操作進行,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli DH 5α感受態(tài)細胞涂平板后,37℃培養(yǎng)過夜。通過菌液PCR及酶切鑒定篩選陽性克隆并送北京華大基因科技有限公司測序。測序結(jié)果用DNAMAN5.2.2軟件進行分析。

2 試驗結(jié)果

2.1 Northern雜交結(jié)果

70個棗樹樣品的RNA提取液,按照1.2.2所述的方法進行雜交,并以含有HSVd全長序列的重組質(zhì)粒pGEM-T-HSVd為陽性對照,點樣量相當于0.25 g植物組織鮮重。雜交結(jié)果顯示：70個山西棗樹樣品中有1個樣品(15號)呈HSVd陽性(圖1)。

2.2 RT-PCR擴增結(jié)果

以Northern雜交檢測到的陽性樣品RNA為模板,使用HSVd P1為引物進行反轉(zhuǎn)錄,使用引物HSV d P2和HSVd P3進行PCR擴增,RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在307 bp處產(chǎn)生特異性條帶(圖2)。

2.3 克隆測序及序列分析結(jié)果

將PCR產(chǎn)物純化后連接到pGEM-T載體上,菌液PCR和酶切鑒定后挑取25個陽性克隆進行測序,共獲得13種HSVd序列。用DNAMAN 5.2.2軟件將所得序列與GenBank中首次報道的HSVd序列(X00009)進行比較分析(圖3),結(jié)果顯示：中國棗樹上分離到的13種HSVd序列與1983年首次報道的HSV d序列(X 00009)有多達23個堿基的差異,約占整個基因組序列的8%。

3 討論

本研究首次在國內(nèi)報道了棗樹上分離得到的HSV d序列。本文將得到的13條HSVd序列與GenBank中首次報道的 HSV d(X 00009)進行序列比對分析,結(jié)果表明：棗樹上分離到的 13種HSV d序列與首次報道的HSVd序列之間有多達23個堿基的差異,同源性為92.6%～92.8%。這說明棗樹上的HSVd序列有其自身的特點。由于目前所采樣品數(shù)量較少,采樣地點有限,因此HSVd在其他地區(qū)或省份棗樹上類病毒的發(fā)生分布情況還需要通過擴大調(diào)查區(qū)域范圍以及進一步增加樣品數(shù)量來確定。本研究為類病毒的有效防控提供了參考,為研究類病毒的起源問題提供了科學數(shù)據(jù)。

圖3 棗樹上分離到的13條HSVd序列與首次報道的HSVd序列(X00009)比對結(jié)果

[1]Diener T O.Potato spindle tuber‘virus’ Ⅳ.A replicating,low molecular w eigh t RNA[J].V irol,1971,45：411-428.

[2]Flores R,Di-Seriof,Hernández C.Viroids：The non-coding genomes[J].SeMin Virol,1997,8：65-73.

[3]Yamamoto H,KagaMi Y,Ku rokaw a M,et al.Studies on hop stunt disease in Japan[J].Rep Res Lab K irin Brew Co Ltd,1973,16：49-62.

[4]Shikata E.New viroid s fromJapan[J].SeMin Virol,1990,1：107-115.

[5]Sano T,H ataya T,Terai Y,et al.Hop stunt v iroid strains fromdapple fruit disease of pluMand peach in Japan[J].JGen Virol,1989,70(6)：1311-1319.

[6]Diener T,SMith D,Hammond R,et al.Citrus B viroid iden tified as a strain of Hop stunt v iroid[J].Plant Disease,1988,72：691-693.

[7]Semancik JS,Roistacher C N,Rivera-Bustamante R,et al.Citrus cachex ia viroid,a new viroid of citrus relationship to viroids of theexocortis disease coMplex[J].JGen V irol,1988,69：3059-3068.

[8]Kofalvi S,Marcos JF,Caìzares MC,et al.H op stunt viroid(HSVd)sequence varian ts fromP runus species：evidence for recombination betw een HSVd isolates[J].JGen Virol,1997,78(12)：3177-3186.

[9]Kawaguchi-Ito Y,Li S F,Tagaw a M,et al.Cultivatedgrapevines represent a symp toMless reservoir for the transmission of Hop stun t viroid to hop crop s：15 yearsof evolu tionary analysis[J].PlosOne,2009,4(12)：e8386.

[10]Guo L H,Liu S X,Wu Z J,et al.Hop stunt viroid(HSVd)new ly reported fromhop in X injiang,China[J].Plant Pathology,2008,57：764.

[11]Zhou Ying,Guo Rui,Cheng Zhoumin,et al.First report of Hop stuntviroid frompeach(Prunus persica)with dapple fruit symptoms in China[J].Plant Pathology,2006,55(4)：564.

[12]Yang Y A,W ang H Q,Cheng ZM,et al.First report of Hop stunt viroid frompluMin China[J].Plant Pathology,2007,56(2)：339.

[13]Yang Y A,Guo R,Wang H Q,et al.First report of Hop stunt viroid in apricotin China[J].Plant Disease,2006,90(6)：828.

[14]Li S F,Guo R,Tsuji M,et al.First reports of tw o g rapevine viroids in China and the possible detection of a third[J].Plan t Pathology,2006,55(4)：564.

[15]Mu L X,W u Y H,LiS F.Identification and characterization of Hop stunt viroid infecting almond in China[J].Jou rnal Plan t Pathology,2009,91(4)：102.

[16]LiS F,Onodera S,Sano T,et al.Genediagnosis of viroids：comparisons of return-PAGE and hybridization using DIG-labeled DNA and RNA probes for practicaldiagnosisofhop stunt,citrusexocortis and apple scar skin viroids in their natural host plants[J].Ann Phytopathol Soc Japan,1995,61：381-390.