IFN-γ基因+874位點基因多態性與肺結核易感性的病例對照研究

王海賓 國文 楊淑嶺 康書慧 劉海云 曹金鳳 田紅衛 檀新云 劉玉肖

結核病是嚴重危害人類健康的重要傳染病之一。早在一百多年前Robert Koch就發現結核分枝桿菌是結核病的致病菌。由于缺乏完善的診斷技術，結核仍然是威脅人類健康傳染病中的“頭號殺手”［1］。事實上，在感染人群中，90% ～95%的感染者處于休眠狀態，僅有5%～10%最終進展為臨床結核病［2］。目前國外已有不少研究探討IFN-γ基因多態性與某些傳染病(如結核病、乙型肝炎、利什曼原蟲等)間的關聯［3－5］，但對于該多態性位點與中國漢族人群結核發生間的關聯研究并不多見。因此，我們采用擴增難控制突變系統PCR(ARMSPCR)方法分析273例肺結核患者、297例對照明人群IFN-γ +874位點基因多態性與肺結核發病間的關聯，并探討可能的基因-環境交互作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例組入選與排除標準:選擇2008年3月至2009年3月石家莊市第五醫院結核科選擇肺結核新發病例，所有病例均按以下國家統一標準確診，即痰菌陽性同時胸X線片有肺結核特征病灶;或痰菌陰性，但胸部X線片示活動性肺結核征象、結核菌純蛋白衍化物(purified protein derivative，PPD)試驗強陽性并具有明顯結核病臨床體征者。

1.1.2 對照組入選與排除標準:選擇同醫院中無結核病史、診斷為其他疾病的患者，或病例的健康同事、親友，對所有對照經X線胸透，排除近期結核感染者，同時排除其他部位結核、肺炎、肺癌、塵肺等結核相似病癥，HIV感染、慢性疾病、腫瘤患者、長期使用激素或器官移植等免疫功能低下者。

1.2 問卷內容 設計統一的調查問卷，由調查組成員對所有研究對象進行面對面的問卷調查，內容包括基本特征(如年齡、性別、籍貫、婚姻狀況、文化程度、居住地、經濟收入等)、生活行為方式(吸煙、飲酒、肉類攝入、居住環境、健身活動等)。既往病史、家族史、結核相關因素接觸史、卡介苗接種史(以研究對象上臂的卡痕來判斷，由專業臨床醫生檢查卡痕并記錄)。利用問卷培訓流調人員，對研究對象進行預調查后進行相關的修訂和改進。

1.3 基因多態性檢測

1.3.1 基因組DNA提取:每個研究對象抽取3 ml血液，EDTA抗凝，全血基因組快速提取試劑盒(天根公司)提取全血中基因組DNA。

1.3.2 基因多態性分析

1.3.2.1 引物設計與合成參:參照文獻［6］設計擴增 IFN-γ 基因第一內含子+874位點的PCR引物，由北京奧科生物技術有限公司合成。其中通用反向引物與特異正向引物1構成第一對，用于擴增于IFN-γ+874A，產物片段為261 bp，通用反向引物與特異正向引物2構成第二對，用于擴增IFN-γ+874T，產物片段為261 bp，內參照正向引物與反向引物構成第三對，用于判定PCR體系的成功與否，產物片段為426 bp。每個樣本均進行兩次PCR反應，如果僅有第一對擴增產物合并內參照產物為陽性，結果判定為+874AA基因型，如果僅第二對擴增產物合并內參照產物為陽性，結果判定為+874TT基因型，如果兩對引物擴增產物合并內參照產物均為陽性，則結果判定為+874A/T基因型。見表1。

1.3.2.2 PCR 反應條件:10 × PCR 緩沖液 3 μl，2.5 mmol/LdNTP Mixture 3 μl，Taq DNA 聚合酶1.5 U，10 μmol/L 的通用反向引物和特異性正向引物各1 μl，10 μmol/L的內對照上、下游引物引物各 0.5 μl，DNA 模板 1 μl，補水至總體積 30 μl。PCR反應條件為95℃熱啟動1 min，進入第一部分循環，95℃、15 s，62℃、50 s，72℃、40 s，10 個循環，然后進入第二部分循環，95℃、20 s，56℃、50 s，72℃、50 s，20 個循環，最后于 72℃ 延伸10 min。

表1 應用ARMS-PCR檢測IFN-g基因多態性

1.3.2.3 擴增產物的分析:PCR擴增產物用含有EB的2%瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，99V恒壓電泳30 min，紫外燈下觀察結果，并用法國VL自動凝膠成像分析系統進行成像和分析。

1.4 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件，用基因計數法計算各組IFN-γ+874啟動子基因型頻率和等位基因頻率，Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗群體代表性。單因素分析估計基因型與疾病的關聯，計算OR值及其95%CI。然后，將是否發病作因變量，各基因型作為自變量，前述有顯著意義的環境相進行多因素非條件logistic回歸分析，最大似然比法估計調整OR值及其95%CI。計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組環境相關的單因素分析 年齡、籍貫、婚姻狀況、文化程度、居住地、經濟收入等因素在2組中的分布無差異。對環境相關的單因素分析，結核患者密切接觸史及卡介苗接種史兩個因素在病例組和對照組中分布有差異，前者是肺結核發生的危險因素，而后者則是疾病發生的保護因素。而健身狀況、吸煙、飲酒等其他因素在2組中分布無差異。

2.2 IFN-γ基因多態性位點與肺結核易感性的單因素分析用基因計數法計算2組人群IFN-γ+874基因型頻率，經Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(P ＞0.05)，符合 Hardy-Weiberg遺傳平衡。在本研究人群中，IFN-γ基因+874AA、AT和TT基因型在病例組中的分布頻率分別為70.33%、28.57%和1.10%，在對照組中的分布頻率分別為70.71%、28.28%和1.01%。見表2。

表2 IFN-γ基因多態性位點與肺結核易感性的單因素分析例(%)

2.3 IFN-γ基因多態性位點與肺結核易感性的多因素分析IFN-γ基因+874位點基因多態性見圖1。以是否發病作為因變量，各基因型為自變量，單因素分析中有顯著意義的密切接觸史和卡介苗接種史為協變量，進行多因素非條件logistic回歸分析。結果顯示調整了接觸史和接種史兩個因素后，IFN-γ基因+874位點基因多態性與肺結核的發生無顯著性關聯(P＞0.05)。將含有等位基因TT和AT組合并，作為參照組AA基因型組與之相比，在病例和對照組中的分布仍無差異(P＞0.05)。見表 3。

圖1 IFN-γ基因+874位點基因多態性

表3 IFN-γ基因多態性位點與肺結核易感性的多因素分析

3 討論

人類IFN-γ基因全長5755 bp，位于常染色體12q14，含4個外顯子和3個內含子。研究發現，IFN-γ基因具有6個多態性位點，分別位于啟動子、內含子1、內含子3，以及3’端非編譯區［7］。研究最多的是與第一內含子5’末端的(CA)12重復序列相鄰的+874位點T/A，+874A/T多態性位點位于轉錄因子NF-kappaβ的結合位點中，且當多態性位點為T等位型時，該結合位點存在［8］。IFN-γ +874T等位序列具有 NF-kappaβ 結合活性，該結合對于IFN-γ的轉錄具有調控作用，使IFN-γ的表達量呈現出個體差異。研究表明+874AA和TT基因型分別為低表達量基因型和 TT為高表達量基因型［6，8］。同時，機體內IFN-γ表達量的高低將直接影響到機體免疫反應效應的強弱，進而影響到疾病的進程及臨床轉歸。在結核感染過程中，IFN-γ是抗MTB感染的保護性因子，高表達量的IFN-γ促進巨噬細胞對抗原的呈遞和自身的活化，啟動機體的免疫反應，從而增加巨噬細胞清除MTB的活性。

研究表明IFN-γ+874A/T基因型與結核病的易感性顯著相關，Lopez-Maderuelo等在對113例痰菌陽性肺結核、207例健康密切接觸者及100例無結核患者接觸史、無BCG接種史的健康對照的研究中發現，攜帶+874AA基因型的個體患結核病的危險性是具有其它基因型個體的3.75倍［6］。同樣，Sallakci也認為攜帶AA基因型的個體患結核的危險性可以增加1.41倍，而攜帶TT基因型的個體患結核的危險性下降至30%［9］。在岡比亞人群［10］、南非人群［11］、克羅地亞人群［12］、巴西人群和印度尼西亞人群［13］中進行了大規模的病例-對照研究，均證實了AA基因型別與宿主對結核病易感性相關。然而，另有研究小組在不同人群進行的類似研究得出的結果與之不符，甚至正好與之相反［14］。

本研究利用病例對照研究將遺傳因素與環境因素綜合考慮，對結核病的危險因素進行了問卷調查，同時通過多因素Logistic回歸分析排除其可能引起的混雜影響，從根本上探討IFN-γ+874A/T基因與結核病易感性的關聯。結果顯示調整了結核暴露史和卡介苗接種史兩個環境因素后，各基因型在病例和對照中的分布無顯著性差異。本研究表明+874A/T基因多態性與結核發病不存在顯著關聯。分析人群中IFN-γ基因與結核病的關聯研究上存在差異的原因，可能是由不同的遺傳背景差異或不同的基因-環境間的交互作用造成，同時我們也不能排排除由于樣本量差別、研究設計差異等客觀因素引起的差異。因此，真正關聯有待在不同人群中和更大樣本量基礎上深入研究。

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