溫針對大鼠腰神經根受壓模型中PLA2的影響

謝艷艷,吳耀持

溫針對大鼠腰神經根受壓模型中PLA2的影響

謝艷艷,吳耀持

(上海交通大學附屬第六人民醫院,上海 200233)

觀察溫針對大鼠腰神經根受壓模型中PLA2的調節作用。將60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、莫比可組、針刺組和溫針組,每組12例。除了正常組外,其他各組通過放置硅膠片建立大鼠腰神經根受壓模型。正常組不造模不治療,模型組造模后不治療,莫比克組、針刺組、溫針組的大鼠分別在造模后予以莫比克灌胃、針刺、溫針治療14 d,14 d后所有大鼠麻醉處死取材,運用生化酶標板微孔檢測法對每組大鼠受壓神經根組織中PLA2進行測定。莫比可、針刺、溫針都可以降低大鼠受壓腰神經根組織中磷酯酶A2(PLA2)的含量(＜0.01,＜0.05),溫針較莫比可和針刺能更明顯地降低PLA2含量(＞0.01,＞0.05)。溫針可以有效地降低大鼠腰神經根受壓模型中的PLA2。

針灸療法;溫針灸;大鼠;椎間盤移位;腰椎間盤突出癥

腰椎間盤突出癥(LDH)是指在腰椎間盤退變的基礎上,纖維環破裂、髓核突出,壓迫和刺激神經根、馬尾等引起的以腰腿痛、坐骨神經痛為主的綜合征[1-6]。本病好發于20～50歲的青壯年,輕者腰腿部不適,重者疼痛劇烈,活動不便,甚者引起馬尾損傷綜合征,嚴重影響患者的生活、工作,對社會生產力造成極大的破壞[7-10]。因此,深入開展本病的病因病理學研究,找到有效的防治途徑,具有重要的臨床價值和社會意義。本實驗建立大鼠腰神經根受壓模型,觀察溫針對模型中受壓神經根組織中PLA2的調節作用,為溫針治療該病提供實驗依據,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑、儀器

選擇3月齡清潔級雄性SD大鼠60只,體重為(250±50)g,由上海交通大學附屬第六人民醫院實驗動物中心提供,購自上海中科院;PLA2試劑盒由美國的R&D systems公司(批號514010)提供;MULTISKAN EX型酶標儀由上海龍華醫院科技中心提供。

1.2 分組和治療方案

60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、莫比可組、針刺組和溫針組,每組12例。正常組不造模,不接受任何治療和處理,自由飲食攝水14 d;模型組造模后不予治療,自由飲食攝水14 d;莫比可組造模后予以莫比克(劑量為成人日劑量的30倍)灌胃連續治療14 d;針刺組造模后予以針刺治療14 d,采用長25 mm針灸針,取穴受壓神經根相應節段右側的夾脊穴,穴位定位參照林文注主編的《實驗針灸學》(上海科學技術出版社出版)有關標準。針刺深度0.5寸,留針20 min;溫針組造模后予以溫針治療,采用長25 mm針灸針,針柄上裝0.50 cm×1 cm的艾粒1顆,燃燒至灰燼,灸2壯,取穴同針刺組。

1.3 大鼠腰神經根受壓模型的建立

手術方法具體操作為,腹腔注射氯胺酮(0.10～0.12 g/kg體重),麻醉滿意后,剪毛,固定,消毒,鋪無菌巾,以L5-6棘突間隙為中心,取后背正中切口,長約4 cm,切開皮膚,鈍性分離椎旁肌,以拉鉤牽開,咬出L5-6棘突、右側椎板和關節突,在手術放大鏡下充分暴露右側L5神經根,將特制的硅膠片[大小4 mm×1 mm×1 mm,重(20±1)mg,先于75%乙醇中消毒3 h,置于0.1%新潔爾滅中保存]置于右側L5神經根出硬膜囊處,局部固定,牢固,逐層縫合,無菌紗布覆蓋,術后大鼠蘇醒,放回籠中觀察。動物造模后,為確認造模成功,處死2只大鼠進行HE染色觀察。詳見圖1。

圖1 正常組與模型組HE染色示意圖

HE染色顯示,正常組可見神經根形態正常,有髓神經纖維大小基本一致,軸突位于中央,髓鞘位于周圍,呈紅色網狀結構。模型組可見神經纖維周圍明顯充血、水腫、炎性細胞浸潤,神經纖維結構松散,周圍神經有髓纖維明顯減少,髓鞘廣泛節段性脫失,血管擴張。提示造模成功。

1.4 統計學方法

1.5 檢測指標及方法

酶的作用是催化底物反應,在底物相對于酶過量的條件下,所有的酶均能與底物結合。本試劑盒使用一種sPLA2的特異性底物,可生成帶巰基的結合物,這種巰基產物可以與DTNB(顯色劑)反應。用酶標儀在405 nm下,測定顯色物的吸光度OD值,根據吸光度OD值反映了底物被水解的量,再根據試劑盒提供的標準品(已知濃度)酶量隨濃度改變的曲線(酶濃度曲線),可推算出PLA2的含量。sPLA2Kit組成分為,①酶標孔板96 Well Plate;②sPLA2 Standard(標準品)0.12 mL;③Reaction Buffer(緩沖液)15 mL;④sPLA2 Substrate(底物)2×3 mL;⑤Color Reagent(DTNB,顯色劑)3 mL;Stop Solution(終止液)3 mL;⑥Plate Cover(封條)1。

準備全部所需試劑,實驗取材樣本和標準品梯度分為①樣本緩沖液為0.1 MTirs 250 mL加0.1 MHCL 240 mL,調pH值為7.5,加1 mm CaCl21.1 g、Kcl7.4 g、TirtonX-100 7 mL、BSA(小牛血清)1 g,加ddH2O定容至505 mL,4oC貯存。②從－80oC冰箱中迅速取出組織,加樣品緩沖液1 mL,冰凍下電動分散器勻漿,4℃離心3500 rpm,15 min,取上清液于離心管中。應用BECKMAN DU800紫外分光光度計進行蛋白定量。③用標準品產生一個濃度梯度,原液(1600m/mL)加入第一支管中。 取出酶標孔板,揭去封條。每個孔中加50mL標準品和樣本。每個孔中加100mL反應緩沖液。每個孔中加50mL底物,輕扣板框將其混勻,膠帶封蓋,37℃孵育30 min。每個孔中加25mL終止液。每個孔中加25mL顯色劑,室溫下顯色10 min。用酶標儀在405 nm下,測定顯色物的吸光度OD值,根據吸光度OD值反映了底物被水解的量。詳見圖2。

圖2 標準品濃度梯度示意圖

圖3 PLA2含量數據計算示意圖

PLA2含量數據計算使用ELISA標準曲線擬合的軟件CurveExpert1.38。CurveExpert為專用的ELISA數據處理和繪圖軟件。將實驗數據輸入軟件,自動生成的,X軸代表濃度,Y軸代表OD值,圖形與試劑盒要求一致。做出標準圖形后,輸入樣品的OD值,軟件就可直接算出樣品的濃度。詳見圖3。

2 結果

正常組PLA2濃度為(14.70±6.70)U/mL,模型組為(43.26±7.45)U/mL,莫比可組為(32.73±7.74)U/mL,針刺組為(28.29±9.60)U/mL,溫針組為(19.29±2.02)U/mL。模型組PLA2濃度與正常組比較,差異具有統計學意義(＜0.01),提示造模成功;莫比可組、針刺組和溫針組PLA2濃度與模型組比較,差異均具有統計學意義(＜0.01,＜0.05),提示莫比可、針刺和溫針均能明顯降低PLA2濃度;溫針組PLA2濃度與莫比可組比較,差異具有統計學意義(＜0.01),提示溫針較莫比可更能明顯降低PLA2濃度;溫針組PLA2濃度與針刺組比較,差異具有統計學意義(＜0.05),提示溫針較針刺能降低PLA2濃度,但是不明顯。

3 討論

腰椎間盤突出癥(LDH)的發病機理,目前尚未徹底闡明。公認的學說主要有3種,即機械受壓學說、化學性神經根炎學說、自身免疫學說[11-14]。傳統的觀點認為LDH的機械壓迫是引起神經根性疼痛的原因,但不能滿意地解釋所有的臨床和病理現象。近年來的研究越來越表明神經根性疼痛的產生決不僅僅是機械壓迫的問題,而是一個相當復雜的病理生理過程。椎間盤組織的降解產物及其通過免疫或非免疫途徑產生的生化物質如磷脂酶A2等細胞因子在其中的作用引人注目。

磷脂酶A2(Phospholipase A2,PLA2)是一種脂解酶,能使糖磷脂水解為溶血磷脂、游離脂肪酸和花生四烯酸,而花生四烯酸在脂氧化酶的作用下又可分解為5-脂氧化酶產物如白三烯 A4、B4、D4、E4和環丙過氧化物如PGG2、PGH2,在環氧化酶作用下又可生成前列腺素E2、血栓素A2、B2等,故PLA2不僅是重要的炎癥介質和致痛物質,也被認為是局部組織炎癥特殊標志[15-24]。Saal等人發現在突出的腰椎間盤中PLA2異常高,髓核標本中PLA2含量超過正常人血漿含量的一萬倍,且認為PLA2是炎癥反應之啟動作用[8]。Ozaktay等[9]將PLA2注入兔子腰小關節囊及附近組織引起急性炎癥反應和神經毒性作用。

腰椎間盤突出癥的治療分為手術治療和保守治療兩方面。針灸治療是保守治療中很重要的一種方法。其中針灸治療腰腿痛歷史悠久。在《內經》中有循經選取下肢腧穴的記載,《素問·刺腰痛》:“衡絡之脈令人腰痛,不可以俯仰,仰則恐仆(樸),得之舉重傷腰?！薄夺t學心悟》中也提到“腰痛拘急,牽引腿足”。

臨床上溫針比針刺和艾灸治療該病效果更明顯。但溫針治療腰椎間盤突出癥的作用途徑和機制尚不清楚,因此有必要進行相關研究。本實驗通過建立大鼠腰神經根受壓模型,分別運用溫針、莫比克、針刺對其進行治療2星期后,運用生化酶標板微孔檢測法對大鼠受壓腰神經根組織中的PLA2進行測定。結果,溫針較針刺、莫比克更能明顯減少大鼠受壓腰神經根組織中PLA2的含量。

[1] 胡有谷.腰椎間盤突出癥[M].第3版,北京:人民衛生出版社,2004: 46.

[2] Mixtter WJ, Barr JS. Rupture of the intervertebral disc with involve- ement of the spinal canal[J]. N England J Med, 1934,211:210-215.

[3] Murphy RW. Nerve roots and spinal nerves in degenerative disc disease[J]. Clin Orthp, 1977,129:46.

[4] Narlor A, Happen F, Turner RL,. Enzyrnic and immunological activity in the intervertebral disc[J]. Orthop Clin North Am, 1975,6: 51.

[5] Eyre DR, Matsui Y, Wu JJ. Collagen polymorphisms of the interver- tebral disc[J]. Biochem Soc Trans, 2002,30:844-848.

[6] Roberts S, Caterson B, Menage J,. Matrix metalloproteinasea and aggrecanase their role in disorders of the human intervertebraldisc[J]. Spine, 2000,25(23):3005-3013.

[7] Ansan R, Tajima N, Chosa E,. Biochemical and morpho- logical changes in herniated human intervertebral disc[J]. Orthop Sci, 2001,6(6):510-518.

[8] Saal JS, Franson RC, Dobrow R,. High levels of inflammatory phospholipase A activity in lumbar disc herniation[J]. Spine, 1990,15: 674-678.

[9] Ozaktay AC, Cavanaugh JM, Blagove DC. Phospholipase A induced eletrophysiologic and histologic changes in rabbit dorsal lumbar spine tissues[J]. Spine, 1995,20:2659-2668.

[10] Chen C, Cavanavgh JM, Ozaktay AC,. Efects of phospholipase on lumbar nerver root structure and function[J]. Spine, 1997,22:1057 -1064.

[11] Willberger RE, Wittenberg RH. Prastagladin release from lumbar disc and facet joint tissue[J]. Spine, 1994,19:2068.

[12] 吳耀持,張彩虹.針刺對腰神經根壓迫癥模型大鼠受損腰神經根超微結構及炎性介質的影響[J].上海針灸雜志,2003,22(9):32- 34.

[13] Peter J. Biology of intervertebral disc aging and degeneration involvement of extracellulor matrix[J]. Spine, 2004,29(23)2691- 2699.

[14] Joseph chang, Steven C, Gilman, Alan J,. Interleukin-activates phospholipase A2 in rabbit chondroctes: A possible signal for IL-1 action[J]. Journal of Immunity, 1986,136:21-25.

[15] 張艷.磷脂酶A2的調節機制[J].吉林醫學,2005,26(12):1374.

[16] Dennis EA. The growing phospholipase A2 superfamily of signal transduction enzymes[J]. Trends Biochem Sci, 1997,22:1.

[17] 陳莉延.磷脂酶A2的研究進展[J].國外醫學生理·病理科學與臨床分冊,2000,20(6):474-475.

[18] Murakami M, Kudo I, Inoue K. Secretory phospholipase A2[J]. Lipid mediators cellssignaling, 1995,12:119-130.

[19] 宓佚群,吳耀持,陳一.溫針灸對大鼠腰神經根受壓模型炎性介質NOS和CGRP調節作用的研究[J].中國針灸,2009,29(1):48-51.

[20] 張峻峰,吳耀持.腰神經根受壓模型大鼠神經根局部炎癥因子對溫和灸的反應[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(45): 9129-9132.

[21] 李振宙,侯樹勛,董玲,等.膠原酶對大鼠急性坐骨神經痛模型體內磷脂酶A2活性的影響[J].中國骨腫瘤骨病,2008,7(1):9-13.

[22] 任大江,李放,張志成,等.等離子髓核成形術對兔退變腰椎間盤內磷脂酶A2活性的影響[J].中國脊柱脊髓雜志,2008,18(5):377- 380.

[23] 張益民,姜鑫,郭永智,等.腰椎間盤退變與炎癥介質[J].實用骨科雜志,2008,14(9):534-536.

[24] 方小林,黃建林.PLA2在腰椎間盤突出癥中作用的研究[J].中醫正骨,2007,19(3):73-74.

The Effect of Warm Needling on PLA2 in a Rat Model of Lumbar Nerve Root Compression

-,-.

’,200233,

To Investigate the regulating effect of warm needling on PLA2 in a rat model of lumbar nerve root compression.Sixty SD rats were randomly allocated to normal, model, Mobic, acupuncture and warm needling groups, 12 rats each. A rat model of lumbar nerve root compression was made by placing a silica gel plate in all the groups except the normal group. The normal and model groups were not treated. The Mobic, acupuncture and warm needling groups were treated by Mobic gavage, acupuncture and warm needling, respectively, for 14 days after model making. All the rats were sacrificed by anesthesia to take the compressed nerve root after 14 days. PLA2 in the compressed nerve roots of each group was measured using enzyme label microtiter plate assay.Mobic, acupuncture and warm needling all decreased PLA2 contents in rat compressed lumbar nerve roots (＜0.01,＜0.05). Warm needling decreased PLA2 contents more markedly than Mobic and acupuncture (＜0.01,＜0.05).Warm needling can effectively decrease PLA2 in a rat model of lumbar nerve root compression.

Acupuncture; Warm needling; Rat; Intervertebral disk displacement; Lumbar intervertebral disc herniation

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.09.631

1005-0957(2011)09-0631-03

上海市科委資助課題(04419723)

謝艷艷(1981 - ),女,醫師

吳耀持(1961 - ),男,教授,博士生導師,研究方向為腰椎間盤突出癥的臨床及實驗研究,E-mail:wuyaochi@ online.sh.cn

2011-03-13