菊苣航天誘變材料RAPD分析及高產品系篩選

韓永芬，盧欣石，舒健虹，付薇，陸瑞霞，覃濤英

（1.北京林業大學林學院草業科學，北京100083；2.貴州省草業研究所，貴州 貴陽550006）

菊苣（Cichoriumintybus）為多年生草本植物，是一種高產優質的飼用牧草，原產于地中海、中亞和北非。菊苣在國外主要用于蔬菜和制糖原料及咖啡代用品。目前，我國登記了2個菊苣品種普那菊苣、將軍菊苣，均為引進品種。普那菊苣（Cichoriumintybuscv.Puna）是20世紀80年代新西蘭科工部草地研究所培育出的菊苣飼用新品種，1985年正式鑒定通過并推廣利用［1］，貴州省草業研究所1997年從新西蘭引進種植，通過引種馴化，并對其進行選育研究，于2005年9月通過貴州省農作物品種審定委員會審定命名為黔引普那菊苣，現已在生產中大量推廣應用。

Damato［2］1991－1993年研究了播種期、種植密度對菊苣種子產量的影響，研究結果表明，意大利半島11月或3月播種，密度以11.1株／m2效果較好，種子產量可達639kg／hm2。新西蘭Hume等［3］1986－1995年對利用普那菊苣建植的混播草地進行了綿羊放牧利用研究，設計了不同混播組合、放牧頻率、利用年限等，在4年內混播草地中普那菊苣所提供產草量在第1～3年增加，第4年減少，提供干物質占混播草地的34%，80%，85% 和57%，普那菊苣、高羊茅（Festucaarundinacea）、大網茅草（Bromuswillednowii，prairie grass）混播是比較好的組合。Boyd和Rogers［4］1997－2003年對普那菊苣的耐鹽性進行了研究，認為在200mmol／L NaCl濃度下，仍生長良好。國內主要是在引種的基礎上開展相關研究，熊先勤等［5］研究了菊苣的生長發育規律，韓永芬等［6］對普那菊苣高產配套栽培技術、不同刈割利用方式進行了研究，左相兵等［7，8］對飼喂肉兔、三元雜交豬進行了試驗，劉鳳霞等［9］對菊苣種子生產技術進行了研究，孫變姿等［10］對菊苣葉提取物對粘蟲的生物活性進行了研究，研究對象均為引進品種，沒有具有自主知識產權的新品種。

在菊苣遺傳多樣性研究方面國外有部分相關報道，Van Cutsem等［11］采用擴增片斷長度多態性（AFLP）標記對菊苣野生種和栽培種之間的基因流動進行了研究；Baes和Van Cutsem［12，13］用同工酶，Kiers等［14］及Koch和Jung［15］用相關序列擴增多態性（RAPD）和AFLP標記說明菊苣栽培種中存在著豐富的遺傳多樣性；國內，羅燕等［16］利用相關序列擴增多態性（SRAP）分子標記技術對不同地理類群的菊苣材料進行了研究，相同或相似地理來源和氣候類型的材料能基本聚在一起，說明遺傳多樣性與地理來源和氣候類型有一定的關系，而在菊苣誘變材料之間的研究沒見相關報道。

航天誘變在苜蓿（Medicagosativa）、紅豆草（Onobrychistaneitica）、沙打旺（Astragalusadsurgens）等豆科牧草上有所應用，并表現出較好的誘變效果［17］。該研究通過對2006年實踐八號育種衛星搭載返回的黔引普那菊苣種子為選育材料，經幾代選育后培育出的新品系進行形態特征比較、RAPD分析及生產性能研究，創造出生產性能好具有自主知識產權的新品系，彌補國內菊苣依賴進口，缺乏自主知識產權的空白，為菊苣新品種選育提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料來源

同時種植2006年航天搭載的黔引普那菊苣材料和地面對照種子，篩選優良的突變材料。SP1代生長期間調查出苗率、存活率、株高、花序長、畸變株率和不育株率等，并與對照植株進行比較，淘汰白化苗、畸變株等。其余正常株孕蕾后套袋，單株收種，將每序脫粒混合起來，用作為SP2代的篩選材料。生長期間在群體中進行觀察調查，以發現有利變異植株。收獲前再根據育種目標對入選脫粒時結合考種，淘汰性狀不良的單序，并分單株進行篩選，入選單株分別收獲脫粒，分別裝代編號，作為播種SP3代的材料，目前選育到SP4代，獲變異材料27份，現表現較穩定，另加上PA－57（黔引普那菊苣）和PA－36（將軍），共計材料29份。試驗材料于2009年9月12日種植于貴州省草業研究所獨山試驗基地，取樣進行RAPD分析的時間為2010年3月4日。

1.2 誘變品系的RAPD分析

1.2.1 DNA的提取 采用寶生物工程（大連）有限公司（TakaRa）植物基因組DNA提取試劑盒。

1.2.2 引物的篩選及反應體系 選2個DNA樣品作模板，對賽百勝公司的100個RAPD引物分別進行PCR擴增篩選，從中選取了15個多態性高、重復性好的引物，在29個種質之間進行PCR擴增，反應體系為：反應總體積為25μL，內含10×buffer，MgCl21.5mmol／L，dNTPs 150μmol／L，TaqDNA聚合酶0.5U，引物1μmol／L，模板30ng，在BIO－RAD公司生產的 MyCyclerTMPCR儀上進行如下程序：92℃3min；92℃1min；35℃1min；72℃2min，循環45次；72℃延伸8min。

1.2.3 PCR擴增產物的檢測 用1×TBE緩沖液配制1.2%（W／V）的瓊脂糖凝膠，PCR擴增結束后，在每個樣品中加入4μL電泳指示液（溴酚藍0.25%，蔗糖40%）混勻，每個泳道上樣22μL，選擇合適的相對分子質量標記（如1 000，750，500bp），在180V電泳2～3h，將凝膠浸于0.5μg／mL的EB溶液中染30～60min，用水清洗凝膠（約10min），在BioSensSC810系列凝膠成像系統上觀察，拍照。

1.2.4 數據記錄與統計 RAPD為顯性標記，同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性。將PCR擴增的DNA電泳條帶作為位點記錄下來，若某個擴增產物在一個樣品中出現，記作“1”，未出現的記作“0”。原始數據的整理采用Excel軟件，利用NTSYS－pc計算遺傳相似系數（DICE系數），并且進行非加權組平均法（UPGMA，unweighted pair－group method with arithmetic means）聚類分析。

1.3 誘變品系的形態特征及生產性能研究

于2009年9月12日將29個品系種植于貴州省草業研究所獨山試驗基地，4個重復，小區面積6m2，在蓮座期每小區取10株共40株觀察葉形、葉色（用草坪比色卡進行分級）、葉脈，并測量葉長和葉寬等。4個重復中留1個重復用于后期的生長觀察，另3個重復用于鮮草產量測定。

2 結果與分析

2.1 菊苣RAPD多態性

15個RAPD隨機引物在供試材料中共擴增出78條帶，擴增片斷大小從100bp到2 000bp（圖1），其中63條具有多態性，總的多態性條帶比率PPB（number of polymorphic bands）為87.77%，平均每個引物擴增出5.2條帶（表1）。進一步比較各個引物的PPB值，有9個引物的多態性條帶比率在80.00%以上，其中引物SA10、SB2、SC3、SC4、SC10、SC13的多態性比率達100%。

2.2 菊苣遺傳相似系數

將擴增所得到的78條片段在NTSYS－pc下計算材料間的遺傳相似系數（GS值）（表1）。GS值的變化范圍為0.60～0.91。基于遺傳相似系數，利用UPGMA法對供試材料進行聚類分析，在聚類圖（圖2）上品系PA－186單成1支，與其他材料之間的相似性較低；剩下的28份菊苣材料的相似性較高，集中為0.69～0.80，其中PA－51、PA－46又各單成1支，與其他材料之間的相似性較低。所選的29份菊苣材料中相似性最高的是PA－92和PA－26，相似性系數高達0.91，相似性最低的是PA－196和PA－18，PA－43和PA－41，兩者之間的相似系數為0.60。

如果以0.74為參照值，29份菊苣材料可以分為6個類群，PA－57、PA－62、PA－92、PA－26、PA－52、PA－89、PA－36、PA－11、PA－93、PA－33為 1 個 類 群；PA－45、PA－95、PA－18、PA－14、PA－42、PA－23、PA－31、PA－96、PA－54、PA－82、PA－85、PA－49、PA－43、PA－8為1個類群；PA－20、PA－41為1個類群；PA－51為1個類群；PA－46為1個類群；PA－186為1個類群。

圖1 引物SE18對菊苣擴增的RAPD圖譜Fig.1 RAPD fingerprint of C.intybus with primer SE18

表1 引物、序列和擴增結果Table 1 Primers，sequences and amplified results

圖2 29份菊苣材料的RAPD聚類分析樹狀圖Fig.2 UPGMA dendrogram for C.intybus based on Nei－Li’s genetic similarity coefficients

2.3 形態特征變化

黔引普那菊苣葉片為披針形，突變后形態特征發生變化，出現橢圓形、羽狀及披針形葉。并且有葉色變淺、葉色變深、葉片變薄、葉片變厚、葉脈出現紫紅色等現象，其部分特征特性見表2，差異顯著性檢驗見表3。

表2 形態學觀察結果Table 2 Observation results of morphologic chatacteristic

續表2 Continued

表3 供試的29個菊苣品系生產性能Table 3 Production performance of 29 C.intybus provided in experiment

2.4 菊苣新品系牧草生產性能

參試29個菊苣品系在株高40cm時刈割，其年產草量結果見表3，經方差分析，產量差異達極顯著水平（P＜0.01），產量高于目前主推品種黔引普那菊苣和將軍的品系有PA－31、PA－43、PA－42、PA－95、PA－11、PA－186、PA－49、PA－20、PA－93、PA－82、PA－54、PA－96。

采用離差平方和法對29個菊苣材料進行聚類（圖3），PA－31、PA－43、PA－42、PA－95、PA－11、PA－186、PA－49、PA－20、PA－93、PA－82為第1類群，產量較高；PA－54、PA－57、PA－36、PA－96、PA－26、PA－8、PA－89、PA－45為第2類群，產量中等；PA－92、PA－14、PA－85、PA－52、PA－46、PA－41、PA－33、PA－51、PA－62、PA－23、PA－18為第3類群，產量較低。

圖3 29個菊苣品系產量聚類圖Fig.3 Production dendrogram for 29 C.intybus strains

3 討論與結論

從RAPD聚類結果和表型特征來看，相似性最高的2份材料PA－92和PA－26，兩者找不到明確的對應關系，從外型看，一個為羽狀葉，一個葉片為披針型，只有葉脈綠色這一共同點。相似性較低的PA－186和PA－18在葉型上基本一致，均為披針形，但葉脈顏色不同，一個為綠色，一個為紫色。而PA－43和PA－41相似性較低，從外型上看也明顯不一致，一個為披針形葉，一個為羽狀葉。但在第1類群中，從葉型上看，除PA－26以外，其余材料均為披針形葉，葉脈顏色以綠色為主。以前的研究表明RAPD方法得到的聚類圖可以反映品種的親本特征及育種歷史，但是聚類結果與表型特征相關性卻較差［18］，對聚類結果與表型特征不完全一致這一現象，該研究有與之相類似的結論。

從菊苣牧草生產性能聚類結果看，產量高于目前主推品種黔引普那菊苣和將軍的品系有PA－31、PA－43、PA－42、PA－95、PA－11、PA－186、PA－49、PA－20、PA－93、PA－82、PA－57、PA－96共12個，且葉型集中為披針形葉和橢圓形葉。有PA－49、PA－11、PA－42、PA－95、PA－82、PA－93、PA－20等7個品系既高產又抗旱［19］，抗旱材料多數集中在RAPD聚類結果中的第2類群。對高產抗逆菊苣新品種選育具有非常重要的實際意義。

在生產利用中建植高產持久性人工草地時為了得到均一的形態外觀，要求所選用品種的形態特征盡可能一致，但是，同時為了提高其抵抗外界生物及非生物脅迫的能力，則品種之間要求有較高的遺傳多樣性。在檢測的29份菊苣材料中，形態特征較一致而相似性系數較低的材料，如PA－93、PA－82都是披針形葉，葉色深綠達9級，有絨毛，葉脈綠色，且比較抗旱、高產，所以適合一起混播建植人工草地。

菊苣作為一種引進牧草品種，國內資源稀有，雖有對不同品種及地域的種質資源進行分析研究的相關報道［11－16］，但從總的來說，研究相對于其他牧草［20］還有差距，目前所獲得有關菊苣遺傳多樣性的信息相對很少，該內容為菊苣研究提供了較為豐富的種質資源，且這樣的信息對于構建分子遺傳圖譜的作圖群體及明確種質資源收集和利用目標非常重要。所以，在今后的研究中，應該通過分子標記建立菊苣分子遺傳圖譜，并加強對該研究中選出的高產抗旱材料進行深入研究，這將有助于檢測植物種內的遺傳變異和分析基因組的結構組成［21］，定位和克隆重要的農藝基因（如抗病、抗旱基因）［22］，檢測和標記數量性狀位點（QTLs），并應用于分子標記輔助育種以改良植物重要農藝［23，24］，及通過采用DNA標記的原位雜交方法構建特定染色體的物理圖譜［25］，為其在生產中應用提供科學的理論依據。

航天誘變在苜蓿、紅豆草、沙打旺等豆科牧草上有所應用，并表現出較好的誘變效果［17］。本研究首次將航天誘變應用于菊科植物菊苣，獲得了部分優良突變材料且能夠穩定遺傳，進一步驗證了航天誘變處理變異頻率高、良性變異多、穩定快的特點。證明通過航天誘變誘導菊苣突變體是有效的，為進一步利用航天誘變，建立突變體庫提供了依據。

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