海馬內注射MK-801對甲醛炎性痛大鼠海馬NO含量的影響

劉凌云 李 欣 李 雯

（上海市楊浦區中心醫院神經內科，上海 200090）

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種具有獨特理化性質和生物學活性的信息和效應分子，兼有信使物質和神經遞質的功能，在神經系統參與多種生理及病理過程的整合[1]。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）陽性神經元廣泛分布在中樞神經系統包括海馬在內的腦區與核團。以往研究證實大鼠足底注射甲醛溶液后，除引起舔、咬注射側腳掌等疼痛反應外，還導致大鼠海馬NOS表達增加，NO產生增多[2]。小鼠側腦室內注射NOS抑制劑L-NAME能夠明顯減輕甲醛誘導的疼痛反應，進一步證實NO在中樞神經系統疼痛整合過程中的重要作用[3]。但是，NO生成增加的機制尚未完全闡明。

大量研究證實，外周應用興奮性氨基酸神經遞質可導致機械痛覺過敏和自發痛，鞘內注射興奮性氨基酸神經遞質可誘發自主傷害性行為和痛覺過敏，興奮性氨基酸神經遞質通過作用于脊髓后角神經元N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體將傷害性信息傳遞致中樞神經系統，NMDA受體參與脊髓水平傷害性傳入信息整合處理[4]。但是，在海馬水平NOS表達增加，NO產生增多是否和NMDA受體活動有關，尚未見相關報道。因此，本研究通過觀察海馬內注射NMDA受體拮抗劑MK-801對甲醛炎性痛過程中海馬NO含量變化情況，以深入探討其內在機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

一氧化氮試劑盒購自南京建成生物工程公司。還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸、氯化硝基四氮唑藍、MK-801均購自美國sigma公司。

1.2 疼痛動物模型構建

大鼠右側后掌底面皮下注射5%甲醛溶液0.2mL構建疼痛模型。

1.3 實驗動物

選用健康雄性SD大鼠28只，由河北醫科大學實驗動物中心提供，體質量260～280g。

1.4 實驗分組

①甲醛組（F）：于大鼠右后掌皮下注射5%甲醛溶液0.2mL，注射甲醛溶液12h后，斷頭開顱取腦，分離雙側海馬，液氮凍存；②甲醛+MK-801組（F+MK-801）：預先于大鼠雙側海馬內各注射2μL MK-801（20nmol）溶液，15min后右后掌皮下注射5%甲醛溶液0.2mL，于注射甲醛溶液12h后，斷頭開顱取腦，分離雙側海馬，液氮凍存。③甲醛+生理鹽水組（F+NS）：預先與大鼠雙側海馬內各注射2μLNS，15min后右后掌皮下注射5%甲醛溶液0.2mL，于注射甲醛溶液12h后，斷頭開顱取腦，分離雙側海馬，液氮凍存；④對照組（Control）：不加任何處理，直接斷頭開顱取腦，分離雙側海馬，液氮凍存。

1.5 雙側海馬置管及注射法[5]

大鼠以10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉后，江灣Ⅰ型C立體定位儀固定頭部，剪開頭皮，暴露頭骨，依據George Paxions& Charles Watson大鼠腦立體定位圖譜，于雙側海馬（A：3.0，LR：1.8，H：3.0）分別埋置不銹鋼套管，以牙科水泥固定于顱骨上。術后應用抗生素3d預防感染，分籠單獨飼養1周后用于實驗。實驗時甲醛+MK-801組采用微量注射器緩慢（0.5μL/min）注射2μL MK-801（20nmol），留針5min后慢慢退出。甲醛+生理鹽水組相同部位注射等體積生理鹽水。實驗結束后注入滂天藍（20g/L）核對注射部位。

1.6 海馬中NO含量的測定

采用硝酸還原酶法進行NO含量測定。蛋白定量用考馬斯亮蘭法。實驗操作按照試劑盒說明進行。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 大鼠痛反應

足底注射甲醛溶液大鼠即出現早期的疼痛反應，如舔、搖動足掌，后掌抬離盒底面等行為學改變。

2.2 海馬內注射MK-801對海馬NO含量的影響

甲醛組與甲醛+生理鹽水組海馬NO含量與對照組比較均明顯升高（P＜0.01），甲醛組與甲醛+生理鹽水組海馬NO含量比較二者之間無顯著差異。與甲醛組相比，甲醛+MK-801組海馬組織NO含量明顯降低（P＜0.01）。同組的左右兩側海馬NO含量比較無顯著性差異（Tab.1）。

Tab.1 Changes in NO content of hippocampus after right hind paw injection of formalin（±s, n=7）

Tab.1 Changes in NO content of hippocampus after right hind paw injection of formalin（±s, n=7）

*P＜0.05 vs control group, ＃P＜0.05 vs formalin group

Group NO content of hippocampus （μmol/g prot）Left Right Control 8.10±0.37 7.91±0.39 F 12.16±0.62* 12.22±0.70*F+NS 12.27±0.43* 12.48±0.71*F+MK-801 9.06±0.46＃ 8.75±0.61＃

3 討 論

有研究報道，急性束縛與制動應激可以引起大鼠海馬興奮性氨基酸谷氨酸含量增加[6]，強迫游泳應激可誘導海馬內NOS表達增加及NO含量明顯升高[7]。因此，本研究認為足底注射甲醛溶液引起的組織損傷可引起劇烈疼痛，炎性疼痛也可作為一種刺激引起機體的應激反應，通過多種上行神經傳導通路，將傷害性信息傳入到海馬，引起海馬內多種神經遞質大量釋放，作用于海馬神經元上的相應受體，激活神經元內一系列信號傳導途徑，引起NO產生的增多。

興奮性氨基酸是中樞神經系統主要的興奮性神經遞質，主要包括谷氨酸及天門冬氨酸，其通過與相應的受體結合參與中樞神經系統的信息傳遞。NMDA受體是一種重要的興奮性氨基酸受體，廣泛分布與脊髓背角神經元。大鼠鞘內注射谷氨酸或天門冬氨酸可誘發疼痛行為反應[8]；鞘內注射NMDA受體拮抗劑可抑制由結扎坐骨神經、皮下注射角叉菜膠所引起的疼痛反應[9]。這說明在脊髓水平，NMDA受體的激活在疼痛信息整合過程中發揮重要作用，而在海馬水平NMDA受體的活動是否參與疼痛信息處理尚無明確定論。本研究發現，海馬內注射MK-801阻斷NMDA受體的活動后，與甲醛12h組相比，MK-801組海馬NO含量明顯降低。以上結果提示，甲醛炎癥性疼痛過程中，海馬組織NO代謝產物含量的增加可能與NMDA受體的活動有關。并且國外已有研究證實，海馬齒狀回內注射競爭性NMDA受體拮抗劑可以產生鎮痛效應，顯著減輕甲醛引起的疼痛反應，支持本實驗結果[10]。

總之，本研究認為，NMDA受體參與了疼痛過程中海馬NO生成增加，NMDA受體與疼痛信息整合密切相關，采取措施阻斷興奮性氨基酸受體有望減輕疼痛，為開發有效、安全的臨床新藥提供了實驗基礎。

[1]王玉賢.血清一氧化氮與低氧血癥對于肝硬化患者關聯分析[J].中國醫藥指南,2010,8(6):175-176.

[2]劉凌云,吳迪,李清君,等.甲醛炎性痛增強大鼠海馬NOS表達和NO產生[J].中國應用生理學雜志,2007,23(1):30-34.

[3]Moore PK,Oluyomi AO,Babbedge RC,et al.L-NG-nitro arginine methyl ester exhibits antinociceptive activity in the mouse[J].Br J Pharmacol,1991,102(1):198-202.

[4]Boettger MK,Weber K,Gajda M,et al.Spinally applied ketamine or morphine attenuate peripheral inflammation and hyperalgesia in acute and chronic phases of experimental arthritis[J].Brain Behav Immun,2010,24(3):474-485.

[5]Wu X,Li HD,Li XC,et al.Effects of intra-hippocampal injection of interleukin-2 on pain threshold and formaldehyde-induced substance P-like immunoreactivity in periaqueductal gray and spinal cord[J].Zhongguo Yao Li Xue Bao,1999,20(9):839-843.

[6]Sunanda,Rao BS,Raju TR.Restraint stress-induced alterations in the levels of biogenic amines,amino acids,and AChE activity in the hippocampus[J].Neurochem Res,2000,25(12):1547-1552.

[7]張艷美,楊權,李康生,等.苯妥英鈉對應激大鼠海馬NO變化的影響[J].中國病理生理雜志,2002,18(8):981-984.

[8]Inturrisi CE.The role of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors in pain and morphine tolerance[J].Nerva Anestesiol,2005,71(7-8):401-403.

[9]Villetti G,Bergamaschi M,Bassani F.Antinociceptive activity of the N-methyl-D-aspartate receptor antagonist N-(2-Indanyl)-glycinamide hydrochloride (CHF3381)in experimental models of inflammatory and neuropathic pain[J].J Pharmacol Exp Ther,2003,306(2):804-814.

[10]McKenna JE,Melzack R.Blocking NMDA receptors in the hippocampal dentate gyrus with AP5 produces analgesia in the