致敏樹突狀細胞疫苗抗小鼠乳腺癌的實驗研究

黃宏思 黃衍強 韋連登

（右江民族醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣西 百色 533000）

樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是目前已知的人體內(nèi)功能最強大的、能唯一激活靜息期T細胞的專職抗原呈遞細胞，具有強大的激活CD8+細胞毒性T細胞（CTL）及CD4+輔助性T細胞的能力。近年來，以DC為基礎(chǔ)的免疫治療作為一種主動特異性細胞免疫治療，逐漸成為人們關(guān)注的焦點。國內(nèi)外的醫(yī)學(xué)研究者嘗試在體外用多種腫瘤抗原致敏DC，然后將其回輸體內(nèi)，望以此打破宿主對腫瘤的耐受，激發(fā)針對腫瘤的主動特異性細胞免疫。本實驗采用將小鼠EMT6乳腺癌細胞株注射到BALB/c小鼠皮下的方法建立小鼠乳腺腫瘤模型，然后觀察乳腺癌抗原致敏樹突狀細胞疫苗對小鼠移植瘤是否有抗腫瘤作用[1-4]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及細胞株

BALB/c雌性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。小鼠EMT6乳腺癌細胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。

1.1.2 主要試劑及儀器

含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（rmGM-CSF）和重組小鼠白細胞介素4（rmIL-4）等購自美國Biosouce。LDH試劑盒購自南京建成公司。酶標(biāo)儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DC的分離及培養(yǎng)

參照文獻[2]采用骨髓分離法并稍作改進。取BALB/c小鼠頸椎脫臼法處死：浸入75%酒精中5～10min，無菌手術(shù)取出股骨；剪去長骨骨端，沖洗骨髓腔，直至骨髓腔變白；收集骨髓細胞，低滲分離去除紅細胞，洗滌離心后用RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，沖洗后按500U/mL rmGM-CSF和200U/mL rmIL-4的終濃度加入培養(yǎng)體系，37℃、5%CO2培養(yǎng)備用。

1.2.2 DC疫苗的制備

取對數(shù)生長期的EMT6細胞反復(fù)凍融[5,6]獲得腫瘤細胞凍融粗提全抗原，于-20℃保存?zhèn)溆谩０碊C與腫瘤細胞為1∶3的比例向DC培養(yǎng)瓶中加入腫瘤細胞凍融抗原，繼續(xù)培養(yǎng)48h，此時的DC即為經(jīng)腫瘤抗原致敏的DC疫苗。

1.2.3 檢測DC誘導(dǎo)CTL的殺傷活性

將24只小鼠隨機分成4組，每組6只。分別在每組小鼠皮下分別注射PBS、凍融腫瘤抗原、未致敏DC和致敏DC，免疫7d后處死小鼠，無菌收集脾臟淋巴細胞作為CTL效應(yīng)細胞，另取EMT6細胞為靶細胞，將效：靶細胞按100∶1、50∶1和25∶1的比例置于96孔板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h。采用定量乳酸脫氫酶（LDH）法檢測CTL殺傷活性，本實驗復(fù)3次，D波長490nm。

CTL殺傷率=（實驗組D值-自然釋放組D值）/最大釋放組D值×100%。

1.2.4 荷瘤小鼠模型的建立

凍存EMT6細胞常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)并傳代，細胞生長至80%～90%，傾去培養(yǎng)液，Hanks液漂洗。2.5g/L胰蛋白酶37℃消化至細胞皺縮變圓。傾去胰酶，加入無血清培養(yǎng)基輕柔吹打形成細胞懸液，離心800r/min 3min。棄上清，再次加入無血清培養(yǎng)基重懸細胞。臺盼藍染色計數(shù)細胞，檢測活細胞比例大于95%，并調(diào)整細胞數(shù)為1×106/mL。

1.2.5 體內(nèi)抑瘤效果檢驗

將32只小鼠隨機分成4組，每組8只。實驗第1d，于各小鼠右前腋下皮下接種處于對數(shù)生長期的EMT6細胞（1×106個/只）。次日，于各組小鼠同側(cè)右前腋下皮下分別注射PBS、凍融腫瘤抗原、未致敏DC和腫瘤抗原致敏的DC疫苗，注射劑量為1×106個DC/只。然后于第7d和第14d分別強化注射1次，劑量同上。當(dāng)皮下腫瘤可觸及后，用卡尺測量腫瘤的縱徑和橫徑，通過公式1/6πab2估算腫瘤體積（a為長軸縱徑，b為短軸縱徑）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DC誘導(dǎo)CTL的殺傷活性的檢測

當(dāng)效：靶比為100∶1時，與PBS對照組比較，抗原致敏的DC細胞誘導(dǎo)的CTL體外對腫瘤細胞有明顯的殺傷作用；而未經(jīng)抗原致敏的DC組和單純腫瘤抗原組與PBS對照組間無顯著性差異。見表1。

表1 CTLs對靶細胞的細胞毒活性（±s，n=9，D490）

表1 CTLs對靶細胞的細胞毒活性（±s，n=9，D490）

注：*：與PBS對照組比較，P＜0.05；#：與PBS對照組比較，P＞0.05

組別 EMT6 100∶1 50∶1 25∶1 PBS對照組 17.3±3.7 10.5±4.3 5.7±3.8未經(jīng)抗原致敏DC組 20.7±4.9# 16.7±5.2 11.9±4.7單純腫瘤抗原組 26.4±5.2# 20.4±4.3 9.5±3.6抗原致敏DC組 40.8±5.6* 35.6±5.4 24.6±5.7

2.2 DC疫苗體內(nèi)抗腫瘤效果檢測

觀察小鼠荷瘤21d。腫瘤抗原致敏DC免疫小鼠組的腫瘤生長得到明顯抑制，體積為（0.248±0.027），與PBS對照組（0.826±0.061）間有顯著性差異；而單純腫瘤抗原組及未致敏DC免疫小鼠組，雖然腫瘤也得到一定的抑制，但與PBS對照組間無顯著性差異。見表2。

表2 DC疫苗對荷瘤小鼠的抗腫瘤作用（±s，n=9）

表2 DC疫苗對荷瘤小鼠的抗腫瘤作用（±s，n=9）

注：*：與PBS對照組比較，P＜0.05；#：與PBS對照組比較，P＞0.05

腫瘤體積（cm3）組別 7d 14d 21d 28d PBS對照組 0.121±0.0620.265±0.057 0.826±0.061 1.004±0.071未經(jīng)抗原致敏DC組 0.153±0.0480.169±0.0720.714±0.059#0.837±0.053單純腫瘤抗原組 0.109±0.0760.237±0.054 0.607±0.062#0.752±0.065抗原致敏DC組 0.051±0.0430.112±0.0360.248±0.027*0.392±0.041

3 討 論

樹突狀細胞（DC）是由美國學(xué)者Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的，是目前所知的機體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細胞，它具有激發(fā)T細胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)對自身抗原耐受等功能。DC系統(tǒng)作為機體內(nèi)免疫應(yīng)答的始動子和調(diào)節(jié)子，具有強大的激活CD8+CTL和CD4+輔助性T細胞的能力，控制著體內(nèi)免疫應(yīng)答的過程，因而成為抗腫瘤免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。近年來，隨著體外大量擴增DC和制備DC疫苗技術(shù)的日趨成熟，采用DC疫苗進行抗腫瘤治療，包括抗乳腺腫瘤治療已成為當(dāng)今腫瘤生物治療領(lǐng)域備受關(guān)注的焦點之一[7-9]。

單純的抗原不能活化T淋巴細胞，必須經(jīng)過抗原提呈細胞（APC）攝取、加工和遞呈，因為T淋巴細胞活化需要抗原和輔助分子雙信號才能有效地誘導(dǎo)CTL形成，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。而腫瘤細胞可通過下調(diào)腫瘤相關(guān)抗原、低表達或不表達MHC分子和共刺激分子，使抗原不能被有效遞呈給T細胞以產(chǎn)生特異性的抗腫瘤效應(yīng)，因此激發(fā)有效的T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答是提高腫瘤免疫治療效果的關(guān)鍵。負載腫瘤抗原的DC疫苗由于可通過DC表面MHC類分子、共刺激分子將腫瘤相關(guān)抗原信息有效地遞呈給T細胞，因此作為理想的腫瘤疫苗在實驗和臨床研究受到廣泛重視[10]。

本實驗結(jié)果顯示，腫瘤抗原致敏DC免疫后小鼠可產(chǎn)生腫瘤特異性CTL，從而有效殺傷腫瘤細胞；而單純腫瘤抗原或未經(jīng)抗原致敏的DC免疫后小鼠則不能產(chǎn)生足夠的具有殺傷腫瘤作用的特異性CTL。經(jīng)過3周DC疫苗免疫治療，腫瘤抗原致敏DC治療組小鼠皮下腫瘤生長得到明顯抑制，與PBS對照組比較，差異有顯著性。由此推斷，DC疫苗治療乳腺癌是一種有效的方法，有望成為乳腺癌免疫治療的新方法。

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