殼聚糖及其衍生物的抑菌試驗研究

盛貽林，葉舟，陳奇

殼聚糖（chitosan）為幾丁質脫乙酰化后的產物，是一種陽離子型多糖，也是目前唯一的商品化堿性多糖，具有無毒、可降解、良好的生物相容性、成膜性及抗菌抑菌等優良特性，在醫藥衛生、食品等方面得到廣泛的應用[1-2]。羧甲基殼聚糖是殼聚糖羧甲基化后的產物，既保留了殼聚糖的優點，又極大地改善了水溶性，因而具有更廣泛的用途，在眾多的殼聚糖衍生物中倍受關注[3]。

大腸桿菌（Escherichia coli），枯草桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是自然界中普遍存在的細菌，也是食品中常見的細菌，對人體危害較大。目前食品中常用的防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鈉等，對人體都具有一定的危害。殼聚糖也可作為食品防腐劑，但是其水溶性不好，限制了它的應用。羧甲基殼聚糖不僅具有防腐性能，而且還具有很好的水溶性[4]。

本文將殼聚糖、羧甲基殼聚糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用進行比較，以期為殼聚糖及其衍生物在醫藥和食品領域的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

殼聚糖和羧甲基殼聚糖購自山東奧康生物科技有限公司；營養瓊脂和蛋白胨購自北京奧博星生物技術有限公司；牛肉膏購自杭州微生物制劑有限公司。大腸桿菌由金華市藥品檢驗所提供；金黃色葡萄球菌由金華市迪耳藥業有限公司提供；枯草芽孢桿菌由中科院微生物研究所提供。

牛津杯內徑 6.0mm，外徑 7.8mm，高 10.0mm。DGG-9240A 電熱恒溫鼓風干燥箱和 SHP-150 恒溫生化培養箱購自上海森信實驗儀器有限公司；LDZX-50KBS 高壓滅菌鍋購自上海申安醫療器械廠；BS-1EA 恒溫振蕩培養箱購自常州國華電器有限公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖、羧甲基殼聚糖的抑菌試驗 將活化后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至 LB 培養基上，搖床培養 24 h 后，分別制成 5‰、10‰ 濃度的菌液備用。在培養皿內加入滅菌后的營養瓊脂，待冷卻凝固后分別加入 0.1 ml 5‰、10‰ 的菌液，用涂布器涂布均勻。每個平皿中均勻地放置無菌的牛津杯 3 只。將殼聚糖和羧甲基殼聚糖分別配制成 2.0、5.0、10.0、20.0 mg/ml 濃度的水溶液，用無菌吸管吸取上述不同濃度的殼聚糖和羧甲基殼聚糖溶液 0.25 ml 于牛津杯中。然后放入培養箱中 37℃培養 24 h，觀察抑菌圈大小，測量抑菌圈平均直徑[5]。

1.2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定 將羧甲基殼聚糖溶液加入牛肉膏蛋白胨培養基中, 使終濃度分別為10.0、5.0、2.0、1.0、0.8、0.5、0.3、0.1 mg/ml，調節 pH 值至 7.0，121℃滅菌 20min。將活化后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液稀釋成 5‰，每培養皿各加 0.1 ml，再加 15 ml 冷卻至 45℃的培養基，搖勻、冷卻后，37℃倒置培養，重復 2 次。以 24 h 后不長菌的濃度為最小抑菌濃度[5]。

1.2.3 不同 pH 值對羧甲基殼聚糖溶液抑菌性能的影響 制備羧甲基殼聚糖含量為5.0 mg/ml 的牛肉膏蛋白胨培養基，用 10%的鹽酸或 10%氫氧化鈉調節 pH 值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，以不加羧甲基殼聚糖的培養基為對照，121℃滅菌 20min，倒平板，冷卻后取 0.1 ml 三種菌懸液接種于相應的培養基上，均勻涂布，重復 2 次。37℃培養 24 h 后菌落計數，計算抑菌率。抑菌率 η =（N0－ N1）/N0（N0、N1分別為對照和加入羧甲基殼聚糖溶液的菌落數）。

1.3 統計學處理

采用 SPSS 13.0 統計學軟件處理數據，數據以±s表示。采用隨機區組設計的方差分析和 Student-New man-Keuls 方法進行統計學分析，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 殼聚糖的抑菌作用

殼聚糖難溶于水，其分散系為懸濁液，基本不能形成抑菌圈，少數在牛津杯的外接圓內也長有菌落，結果見表1。

表1 殼聚糖的抑菌效果

2.2 羧甲基殼聚糖的抑菌作用

羧甲基殼聚糖對三種菌的抑菌作用見表2。經方差齊性檢驗，顯示方差齊。說明羧甲基殼聚糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌作用，且對三種菌的抑菌作用有顯著性差異（P＜0.05），其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，對枯草芽孢桿菌的抑菌作用次之，對大腸桿菌的抑菌作用相對較弱。

表2 羧甲基殼聚糖的抑菌效果（±s）

表2 羧甲基殼聚糖的抑菌效果（±s）

抑菌圈直徑（mm）濃度（mg/ml） 金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌 大腸桿菌2.0 15.22±0.12 12.90±0.41 8.10±0.05 5.0 16.24±0.15 13.12±0.07 8.30±0.41 10.0 18.23±0.30 14.22±0.03 9.20±0.22 20.0 20.25±0.13 16.16±0.36 10.24±0.08

2.3 MIC 值的測定結果

試驗結果表明，羧甲基殼聚糖對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌最低抑菌濃度分別為0.5 mg/ml，0.8 mg/ml 和 2.0 mg/ml。由此可知，金黃色葡萄球菌對羧甲基殼聚糖的抑菌作用最為敏感，其次是枯草桿菌，大腸桿菌的敏感性較上述兩種細菌相對弱一些。

2.4 pH 值對羧甲基殼聚糖抑菌作用的影響

圖1 顯示羧甲基殼聚糖在 pH 5.5～6.0 范圍內對大腸桿菌有很好的抑制作用，并隨著 pH 值的升高而降低。pH＜5.0 時由于環境過酸，未見或少見細菌生長；pH ＞ 6.0 時，羧甲基殼聚糖的抑菌作用明顯降低，但仍然有一定的抑制作用。

圖2 顯示羧甲基殼聚糖在 pH 5.0～6.5 范圍內對枯草芽孢桿菌有明顯的抑菌作用，并隨著 pH 值的升高先降低再升高，至 pH 6.5 出現峰值，pH 值超過 6.5 開始明顯降低。pH＜5.0 時由于環境過酸，少見細菌生長；pH ＞ 7.0 時，羧甲基殼聚糖的抑菌作用明顯降低。

圖3 顯示羧甲基殼聚糖在 pH 5.5～6.5 范圍對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，并隨著 pH 值的升高先降低再升高，至 pH 6.0 出現峰值，pH＜4.0 時由于環境過酸，少見細菌生長；pH ＞ 6.5 時，羧甲基殼聚糖的抑菌作用明顯降低。

圖1 pH 值對羧甲基殼聚糖對大腸桿菌抑菌作用的影響

圖2 pH 值對羧甲基殼聚糖對枯草芽孢桿菌抑菌作用的影響

圖3 pH 值對羧甲基殼聚糖對金黃色葡萄球菌抑菌作用的影響

3 討論

殼聚糖由于難溶于水，其分散系為懸濁液，基本不能形成抑菌圈。羧甲基殼聚糖對三種菌都有明顯的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，其次是枯草桿菌，對大腸桿菌的抑菌作用較上述兩種細菌相對弱一些。同時羧甲基殼聚糖的 pH 值對三種菌的抑菌作用也有一定的影響。

羧甲基殼聚糖的抑菌作用與氨基和分子大小有關，酸性環境有利于殼聚糖氨基的質子化，質子化殼聚糖進入菌體細胞內，吸附結合一些帶負電的細胞質，擾亂菌體細胞的正常生理代謝，從而抑制細菌生長。可見，適當的酸性環境對羧甲基殼聚糖的抑菌作用是必需的。

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