以 FOXP3為靶點的免疫抑制劑藥物篩選模型的建立

巫曄翔，司書毅，蔣建東，唐巍然

在 20 世紀 70年代曾有學者發現一群 T 細胞具有免疫抑制功能，但直至 1995年Sakaguchi等[1]發現 CD4+CD25+ 為調節性 T 細胞的表面標志后，人們才開始對調節性 T 細胞的分化、發育和功能進行深入的研究，并發現轉錄因子FOXP3在調節性 T 細胞中的作用，開始關注調節性 T 細胞在維持機體免疫耐受，防止自身免疫性疾病的發生，抗移植物排斥以及腫瘤免疫中的重要作用。

FOXP3是一種具有叉頭螺旋（forkhead/winged helix）結構的轉錄調節因子[2]。它的基因編碼產物是一個分子量為48 kD 的 Scurfin 蛋白質。它主要表達于 CD4+/CD25+ 調節性 T 細胞，是決定調節性 T 細胞免疫抑制功能的關鍵基因。盡管有關FOXP3的信號傳導途徑還有待進一步研究，但Hori 等的研究表明FOXP3能夠特異性地表達于CD4+ 的調節性 T 細胞，CD4+/CD25- 細胞在轉染FOXP3基因后能夠賦予這些細胞具有調節性T 細胞的表型，具有高表達水平的 CD25、CD103、GITR、CTLA4 和低水平表達的細胞因子[3-5]，是控制調節性 T 細胞發生分化的關鍵性轉錄因子。轉染FOXP3基因的 CD4+/CD25– 細胞在體外通過細胞間接觸可發揮其免疫抑制功能，在體內能夠抑制自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發生。FOXP3還能夠抑制自身反應性 T 細胞功能，FOXP3功能缺陷會導致許多自身免疫病的出現如：糖尿病、濕疹、變態反應性疾病、淋巴細胞增生等。而FOXP3功能的異常增強也會導致病理性的免疫抑制和腫瘤疾病的發生[6-7]。

這些研究結果表明調節性 T 細胞中的轉錄因子FOXP3不僅有望成為治療自身免疫病，變態反應性疾病和解決移植排斥反應難題的作用靶點，而且也可能成為腫瘤免疫學治療中的理想治療靶點之一。盡管已有瞬時表達FOXP3細胞用于研究其功能的報道，但有關建立以FOXP3為靶點永久、穩定細胞系用于高通量篩選免疫抑制劑的細胞模型，尚未見文獻報道。為此，我們將轉錄調節因子FOXP3基因啟動子克隆到 pGeneBLAzer-TOPO載體中并與報告子 β-內酰胺酶相偶聯，建立以FOXP3為靶點的免疫抑制劑藥物篩選模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒，菌株和細胞株：真核細胞表達載體pGeneBLAzer-TOPO 為美國 Invitrogen 公司產品；大腸桿菌E.coliDH5α 為大連寶生物工程公司產品；Jurkat 細胞株為中國醫學科學院基礎醫學研究所提供。

1.1.2 主要試劑 轉染試劑（Lipofectamine 2000）購自美國 Invitrogen 公司；基因組提取試劑盒、DNA 回收試劑盒、DNA 聚合酶（PrimeSTARTMHS DNA polymerase）購自大連寶生物工程公司；G418購自美國 Amresco 公司；PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate）和 Ionophore 購自美國 Sigama 公司；前列腺素 E2（PGE2）購自美國 Cayman Chemical公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的體外擴增 用廣譜基因組DNA 抽提試劑盒從正常人外周血單核細胞中分離基因組 DNA，并以此為模板，通過自行設計引物，使用 PrimeSTARTMHspolymerase 進行 PCR 擴增FOXP3啟動子全區域 1834 bp。

1.2.2 重組質粒的構建和鑒定 將 PCR 擴增的DNA 片段切膠回收純化，T-A 克隆至pGeneBLAzer-TOPO 載體上，轉化至E.coliDH5α中增殖擴增，提取純化質粒，通過 PCR 選擇插入正方向片段的質粒克隆，測序鑒定插入片段的DNA 全序列，選取與 GeneBank AF235097 序列有100%同源性的克隆作為轉染用質粒。

1.2.3 重組質粒轉染細胞和建立穩定轉染細胞株 將 Jurkat 細胞培養于 6 孔無菌培養板內，培養基為不含抗生素的 RPMI 1640 培養液。采用脂質體法用 LipofectamineTM2000 Reagent 試劑盒轉染FOXP3啟動子/pGeneBLAzer-TOPO 載體于培養的 Jurkat 細胞后，置于 37℃二氧化碳培養箱內，培養 18～48 h。其間每 6～8 h 換液一次，用新鮮的含 10%FBS 的 1640 無雙抗培養液換掉轉染液，繼續培養 24 h。以含 G418 1100 μg/ml 的選擇性培養基篩選穩定轉染細胞株。

1.2.4 轉染細胞株中外源性基因穩定性的鑒定 將經 G418 選擇性培養基篩選的穩定轉染細胞株，經多次傳代后，以未轉染的 Jurkat 細胞為對照，用基因組提取試劑盒提取 Jurkat 細胞基因組，以 PCR 擴增融合載體中FOXP3啟動子DNA 片段。

FOXP3擴增引物：上游引物：T7 promoter primer（源自 pGeneBLAzer-TOPO 載體）：5’ TAAT ACGACTCACTATAGGGA 3’；下游引物：primer 2（源自FOXP3啟動子序列）：5’ ACCTTACCTGG CTGGAATCACG 3’，片段長度：1934 bp。

管家基因GAPDH：上游引物：5’ CAACGGAT TTGGTCGTATTG 3’；下游引物：5’ CTTCCACGAT ACCAAAGTTGTC 3’，片段長度：493 bp。

1.2.5 轉染細胞株中FOXP3基因啟動子活性的檢測 以 PMA 20 ng/ml、Ionophore 1 μg/ml 和PGE226 μm 單獨和聯合刺激穩定轉染細胞株 18 h后[8]，將 GeneBLAzer Detection kits 提供的熒光底物（CCF2-AM）加入細胞中后移至 96 孔培養板中室溫孵育 1 h。通過熒光檢測儀讀取 460 nm 藍色熒光數值（a）和 530 nm 的綠色熒光數值（b）。β-內酰胺酶活性評價采用比率制讀數：Ratio = a/b，當 β-內酰胺酶上游的FOXP3啟動子對刺激物反應，驅使下游 β-內酰胺酶表達時在加入底物的細胞群中呈現藍色熒光，反之細胞群中則呈現綠色熒光。

2 結果

2.1 目的基因的體外擴增

以人類基因組 DNA 為模版，PCR 擴增FOXP3啟動子全長，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，獲得 1.8 kb 的 DNA 片段，如圖1 所示。

圖1 PCR 擴增產物人類 FOXP3 基因啟動子的瓊脂糖凝膠電泳檢測Figure 1 Human FOXP3 promoter fragment amplified with PCR was analyzed by gel electrophoresis

2.2 重組質粒的構建和測序鑒定

圖2 FOXP3 啟動子/pGeneBLAzer-TOPO 重組載體模式圖Figure 2 The schema for construct FOXP3 promoter/pGeneBLAzer-TOPO

圖3 人類 FOXP3 啟動子序列（GenBank accession NO.AF235097）Figure 3 Sequence of human FOXP3 promoter region(GenBank accession NO.AF235097)

如圖3 所示，將此 PCR 擴增產物克隆至pGeneBLAzer-TOPO 載體中，挑取含有插入正向片段質粒的菌落，提取菌落精制質粒。使用 T7 promoter primer 和自行設計的引物對上述質粒進行 DNA 測序（圖3）。其中 CTB573-23DNA 序列與文獻[9]報道以及 GeneBank 中所登錄的序列具有高度同源性。其余克隆都不同程度上存在有若干突變點。故選擇該克隆融合載體作為轉染細胞用質粒。

2.3 轉染細胞株中外源性基因穩定性的鑒定

以未轉染的 Jurkat 細胞為對照，用基因組提取試劑盒提取轉染 Jurkat 細胞及對照組細胞基因組，以其為模板，PCR 擴增確定 Jurkat 細胞基因組中是否整合有已構建的FOXP3啟動子/pGeneBLAzer- TOPO 載體。結果表明：以對照Jurkat 細胞基因組為模板，以 pGeneBLAzer-TOPO載體序列為上游引物，以FOXP3啟動子序列為下游引物的 PCR 產物中沒有擴增出任何 DNA 片段（圖4，Lane 2），而穩定轉染有融合載體的兩個Jurkat 細胞株卻能夠擴增出長度為1.9 kb 的DNA 片段，如圖4 中 3～4 泳道所示。在以轉染細胞與對照細胞基因組為模板的管家基因GAPDH 的 PCR 中均能擴增出長度為493 bp 的GAPDH DNA 片段（圖4，Lane 5～7）。上述結果表明：穩定轉染的 Jurkat 細胞基因組中已整合有已構建的啟動子融合載體，并能夠穩定地隨 Jurkat細胞傳代培養。

圖4 PCR 擴增轉染細胞基因組片段的瓊脂糖電泳檢測Figure 4 The fragments of transfectant genome amplified with PCR were analyzed by gel electrophoresis

2.4 陽性對照 PGE2 對穩定轉染細胞中目的基因啟動子活性的影響

以 PGE226 μm 以及 PMA 20 ng/ml 和Ionophore 1 μg/ml（PI）單獨和聯合刺激穩定轉染細胞株 18 h 后，將 GeneBlazer Detection kits 提供的熒光底物（CCF2-AM）加入細胞中后移至 96 孔培養板中室溫孵育 1 h。通過熒光檢測儀讀取 460 nm藍色熒光數值和 530 nm 的綠色熒光數值。結果如圖5 所示：PGE2以及 PI 均能夠提高FOXP3啟動子活性。該實驗結果表明：啟動子刺激物能夠有效地作用于已構建的FOXP3啟動子/pGeneBLAzer-TOPO 載體，啟動子活性能夠通過其下游的報告子β-內酰胺酶活性得以準確的反映。利用該模型我們篩選了研究所內 2500 余種天然產物，獲得 4 種對FOXP3啟動子具有上調作用的天然產物（圖6），這些結果表明：該模型具有用于以FOXP3基因為靶點的藥物篩選可行性。

圖5 以 β-內酰胺酶報告子檢測 Jurkat 細胞 FOXP3 啟動子活性。分別用 PGE2（26 μm）；PI（PMA 20 ng/ml 和Ionophore 1 μg/ml）和 PI/PGE2 刺激 Jurkat 細胞株Figure 5 FOXP3 promoter activity was analyzed by fluorescent detection of β-lactamase reporter activity in Jurkat cell lines.Jurkat was stimulated with PGE2 (26 μm); PI(PMA 20 ng/ml and Ionophore 1 μg/ml) and PI/PGE2

圖6 用篩選模型高通量篩選 2500 余種天然產物Figure 6 2500 natural products were screened using the screening model

3 討論

在本項研究中，我們克隆了FOXP3基因啟動子片段，構建了FOXP3基因啟動子/pGeneBLAzer-TOPO 載體，建立了穩定轉染該融合載體的 Jurkat細胞株。探討了陽性對照 PGE2對穩定轉染細胞中目的基因啟動子活性的影響，同時篩選了我們研究所中的 2500 余種天然產物。

我們從人類外周血單核細胞中提取人類基因組，并以其為模板 PCR 擴增FOXP3基因啟動子片段，測序結果表明該區域序列與 GenBank AF235097 具有100%的同源性，真核細胞核心啟動子的標志性元件 TATA、GC、CAAT box 均存在于啟動子區域中，并含有 NFAT、AP-1 等轉錄因子結合位點和 TSS 轉錄起始位點[9]。

我們將轉錄因子FOXP3基因啟動子克隆到pGeneBLAzer-TOPO 載體，并與報告子基因 β-內酰胺酶相偶聯，經 G418 抗性篩選和外源性基因穩定性的鑒定結果表明：穩定轉染 Jurkat 細胞株的基因組中整合有FOXP3啟動子/pGeneBLAzer-TOPO 載體，并能夠穩定地隨 Jurkat 細胞傳代培養。這表明我們已得到有穩定轉染靶基因啟動子的細胞株。在檢測刺激物對FOXP3啟動子活性影響的實驗中，我們選擇文獻[8]報道的 PGE2用于檢測陽性刺激物對穩定轉染細胞中FOXP3啟動子活性的影響，實驗結果表明：陽性刺激物能夠提高穩定轉染細胞中FOXP3啟動子活性，而 PGE2對經 PI 激活的 Jurkat 細胞對啟動子活性的影響要優于單獨使用 PGE2。PGE2、PMA 和 Ionophore 對FOXP3啟動子活性的影響以及高通量篩選 2500余種天然產物的實驗結果表明：我們建立的藥物篩選模型能夠適用于檢測該啟動子活性，具有進行高通量藥物篩選的可行性。有關已得到的陽性天然產物對FOXP3基因表達的影響目前正在研究中。

[1]Sakaguchi S.Naturally arising CD4+ regulatory Tcells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses.Annu Rev Immunol, 2004, 22:531-562.

[2]Suhubert LA, Jeffery E, Zhang Y, et al.Scurfin (FOXP3) acts as a receptor of transcription and regulatory T cell activation.J Biol Chem,2001, 276(40):37672-37679.

[3]Ramsdell F, Ziegler SF.Transcription factors in autoimmunity.Curr Opin Immunol, 2003, 15(6):718-724.

[4]Sakaguchi S, Sakaguchi N, Shimizu J, et al.Immunologic tolerance main2 tained by CD25+ CD4 + regulatory T cells: their common role in controlling autoimmunty, tumor immunity, and transplantation tolerance.Immunol Rev, 2001, 182:18-32.

[5]McHugh RS, Whitters MJ, Piccirillo CA, et al.CD4(+)CD25(+)immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.Immunity,2002, 16(2):311-323.

[6]Hori S, Nomura T, Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.Science, 2003,299(5609):1057-1061.

[7]Kim JM, Rasmussen JP, Rudensky AY.Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice.Nat Immunol, 2007, 8(2):191-197.

[8]Baratelli F, Lin Y, Zhu L, et al.Prostaglandin E2 induces FOXP3 geng expression and T regulatory cell function in human CD4+ T cells.J Immunol, 2005, 175(3):1483-1490.

[9]Mantel PY, Ouaked N, Rückert B, et al, Molecular mechanisms underlying FOXP3 induction in human T cells.J Immunol, 2006,176(6):3593-3602.