中國南方不同品系福壽螺對廣州管圓線蟲易感性的研究*

曾清香,孫志堅,張 波,彭東覺,曲振宇,楊 蕭,吳忠道,詹希美,何 藹

福壽螺(Pomacea canaliculata,Lamarck 1822)原產于南美洲,屬外來入侵物種[1],其可作為廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonensis,Chen 1935)的中間宿主引起人嗜酸性腦膜腦炎[2]。自從Nomura和 Lin[3]報道了首例人感染廣州管圓線蟲以來,至1992年已經有大約30個國家有病例的報道[4]。而在中國,在1996年之前,廣州管圓線蟲感染的病例只有3例,而近些年來,浙江、福建、北京等地先后出現廣州管圓線蟲病暴發,使得此數目迅速增加[5]。在幾次廣州管圓線蟲大暴發流行中,均與福壽螺有關,Prociv等[6]甚至認為福壽螺已經成了印度洋-太平洋區廣州管圓線蟲病流行的首要因素。

有關福壽螺殼的變異,早在19世紀就有人注意到,由于福壽螺適應能力強,分布范圍廣,其攝食、繁殖、活動的情況都可能在不同地區有不同的變化[7],因此其變異應該會更多[8]。2000年中國就有人指出福壽螺可分為黑色福壽螺和黃色福壽螺[9],我們在對中國廣州各地福壽螺的觀察中發現,除了上述依據殼色分類的兩類福壽螺外,還存在另外一類。依照傳統的命名,我們將其稱為灰色福壽螺,這是通過對福壽螺外殼和軟體部綜合觀察得出的[10]。本實驗主要研究了三類福壽螺對廣州管圓線蟲的易感性。

1 材料與方法

三類福壽螺的外形特點及來源[10]外形特點:(1)黑色福壽螺(見圖1a):殼為棕綠色,上有數量不等的黑色色帶,厴為深褐色,軟體部包括唇須、觸角、呼吸管、足等均為黑色;(2)黃色福壽螺(見圖1b):殼為棕黃色,不含色帶,厴亦為金黃色,軟體部包括唇須、觸角、呼吸管、足等均為黃白色;(3)灰色福壽螺(見圖1c):殼的外觀肉眼見與黑色福壽螺無區別,但軟體部,尤其在唇須、觸角、呼吸管、足邊緣可見大量黃色斑點。

依據以上外形特點采集福壽螺樣本,大部分黑色福壽螺來自中國科學院華南植物園池塘,少量來自華南農業大學試驗田水渠;大部分黃色福壽螺來自華南農業大學試驗田水渠,少部分來自廣州農業科學研究所和中國華南植物園;所有灰螺均來自廣州農業科學研究所。

圖1 3類福壽螺外部形態a黑色福壽螺、b黃色福壽螺、c灰色福壽螺。上圖顯示螺殼形態,下圖顯示爬行時外露軟體部形態。Fig.1 External features of three types of P.canaliculata1a,1b and 1c represented black P.canaliculata,yellow P.canaliculata and grey P.canaliculata respectively.And the upper showed the shells and the lower part showed the soft parts when they was crawling

1.2 廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲(First stage larvae of A.cantonensis,L1)的獲得 將野外感染廣州管圓線蟲的褐云瑪瑙螺(采自廣州大學城)去殼,軟組織剁碎后置于人工消化液(按2g胃蛋白酶、7mL濃鹽酸、1 000mL蒸餾水配制)內,于 37℃溫箱中消化90min并在解剖鏡下分離廣州管圓線蟲三期幼蟲(Third stage larvae of A.cantonensis,L3),將檢出的L3活蟲40條灌胃感染SD大白鼠,6周后,收集新鮮鼠糞并用Baermann技術[11]分離L1。

1.3 福壽螺感染過程 預先將3類福壽螺各100只按上述消化褐云瑪瑙螺的方法消化并查找L3,結果均無廣州管圓線蟲感染,證明實驗用福壽螺均無野外感染。取三類福壽螺各90只,每類再隨機分為3組,每組30只。分別記為黑色福壽螺Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組;黃色福壽螺Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組;灰色福壽螺Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組。各組螺于感染前兩天停止喂食。Ⅰ組作為陰性對照組,不感染廣州管圓線蟲;Ⅱ、Ⅲ組分別為低劑量感染組和高劑量感染組,分別用每只螺500條和2000條L1的感染量感染福壽螺24 h,24 h后再使用相同劑量重復感染1次,即相當于低劑量感染組感染量為每只螺1 000條L1,高劑量組為4 000條。

感染時,將各組福壽螺置于相同規格的水盆中,加水至恰能淹沒所有福壽螺,再加入預定數量的L1(對照組加入相同體積的水),使福壽螺在含L1的水中感染24h。感染完成后,將所有螺置于有流動水的大池中,喂以足量蔬菜。35d后,將所有螺取出,分別去殼取軟組織,將軟組織剁碎后每克螺肉加入20mL人工消化液(同上),置于37℃溫箱中消化90min。在解剖顯微鏡下查找L3,按照Hata等[12]的描述對L3進行鑒定,并計數。

1.4 觀察指標 實驗前稱取各組福壽螺重量,分別于感染前、感染后、感染后7、14、21、28和35 d觀察各組福壽螺活動度,觀察并記錄整個過程中螺的死亡數量,稱取實驗后各組福壽螺重量,記錄各螺感染L3數,并計算感染率、感染度、蟲密度(感染度/螺重量)。感染度為每只福壽螺感染L3的數量。

福壽螺活動度的觀察:將福壽螺取出置于水盆中,加水至淹沒所有螺,搖晃水盆以使所有螺均退回殼內。觀察并記錄 1min、3min、5min和10min開始活動的福壽螺數量,并計算活動率(活動螺數/總螺數)。福壽螺活動以伸出呼吸管或露出觸角或開始爬行為標準。

1.5 數據統計 使用SPSS13.0對數據進行統計。福壽螺實驗前后重量用t檢驗;死亡率及感染率運用χ2檢驗;感染度及蟲密度運用秩和檢驗;運用spearman相關分析,對感染L3福壽螺重量及感染度進行相關分析。

2 結 果

2.1 實驗前后實驗組福壽螺重量 分別稱取了實驗組實驗前后各福壽螺的重量,見表1。運用T檢驗對各組福壽螺實驗前后重量進行兩兩比較,均無差別(P＞0.05)。說明在實驗的30余天中,福壽螺并無生長。在同一組中,灰色福壽螺均小于黑色福壽螺和黃色福壽螺(P＜0.05),在Ⅲ組中,黑色福壽螺小于黃色福壽螺(P＜0.05),而在Ⅱ組中,黑色福壽螺與黃色福壽螺重量無差異(P＞0.05)。

表1 實驗前后實驗組福壽螺重量Table 1 Comparison of snails'weights between pre-and postinfection

2.2 福壽螺活動度的變化 福壽螺活動率變化幅度較大,可能與外界環境如當日溫度、天氣等不同有關。但同陰性對照組相比,可見感染組活動率在感染完成后和感染后7 d明顯下降,隨后逐漸上升,尤以Ⅱ組明顯,至感染后28 d時,實驗組與Ⅰ組差別已不明顯;另外,Ⅲ組活動率較Ⅱ組下降明顯(見圖2a)。相同組中,三類螺活動率無明顯規律(見圖2b)。

圖2a 各組黃色福壽螺不同時間5min時活動率圖2b Ⅲ組不同類福壽螺5min時活動率Fig.2a Activity rate of yellow P.canaliculata at 5thminuteFig.2b Activity rate of dif ferent P.canaliculata in GroupⅢat 5thminute

表2 各組福壽螺死亡及感染情況Table 2 Infection status of different groups

2.3 死亡率 實驗結束時,黑色福壽螺死亡率Ⅰ組為 6.67%(2/30)、Ⅱ組為 10%(3/30)、Ⅲ組為13.3%(4/30);黃色福壽螺死亡率Ⅰ組為26.67%(8/30)、Ⅱ組為6.67%(2/30)、Ⅲ組為10%(3/30);灰色福壽螺死亡率Ⅰ組為20%(6/30)、Ⅱ組為20%(6/30)、Ⅲ組為30%(3/30),見表 2。運用 χ2檢驗,黑色福壽螺各組兩兩比較死亡率無差異(P＞0.05);黃色福壽螺Ⅰ組死亡率高于Ⅱ組和Ⅲ組(P＜0.05),Ⅱ組和Ⅲ組之間比較無統計學意義(P＞0.05);灰色福壽螺各組兩兩比較死亡率無差別(P＞0.05)。運用χ2檢驗對相同組不同類螺死亡率進行檢驗得出,Ⅰ組黃色福壽螺死亡率高于Ⅰ組黑色福壽螺(P＜0.05),而與Ⅰ組灰色福壽螺比較無明顯差異(P＞0.05),Ⅰ組黑色福壽螺與灰色福壽螺比較無差別(P＞0.05);Ⅱ組中三類福壽螺死亡率兩兩比較無統計學意義(P＞0.05);Ⅲ組中三類螺死亡率兩兩比較亦無差異(P＞0.05)。

2.4 感染率 Ⅰ組三類螺均無感染;Ⅱ組中,黑色福壽螺、黃色福壽螺、灰色福壽螺的感染率分別為48.15%(13/27)、25%(7/28)、33.33%(8/24),兩兩比較無統計學意義(P＞0.05);Ⅲ組中,黑色福壽螺、黃色福壽螺、灰色福壽螺感染率分別為61.54%(16/26)、40.74%(11/27)、76.19%(16/21),灰色福壽螺感染率高于黃色福壽螺(P＜0.05),其余兩兩比較無差別(P＞0.05)。同類螺Ⅱ組與Ⅲ組比較,除灰色福壽螺Ⅲ組感染率明顯高于Ⅱ組(P＜0.01)外,其余兩類螺高劑量感染組與低劑量感染組感染率無差別(P＞0.05)。

2.5 感染度及蟲密度 Ⅱ組和Ⅲ組3類福壽螺之間感染度及蟲密度均無明顯差別(P＞0.05);同類螺不同組間進行比較,黑色福壽螺和灰色福壽螺Ⅱ組和Ⅲ組間比較感染度和蟲密度均無明顯差別(P＞0.05),黃色福壽螺Ⅱ組和Ⅲ組感染度有差別(P＜0.05),Ⅲ組高于Ⅱ組,蟲密度無差別(P＞0.05)。福壽螺最低感染度出現在Ⅲ組灰色福壽螺,最高感染度出現在Ⅲ組黑色福壽螺(見表2)。將福壽螺感染廣州管圓線蟲數量分為三個等級(見圖3):小于100條、100-500條和大于500條。Ⅱ組無感染大于500條螺存在,小于100條的福壽螺占多數;Ⅲ組中開始出現感染大于500條L3的螺,甚至超過 1 000條。

圖3a Ⅱ組3類福壽螺的感染情況圖3b Ⅲ組3類福壽螺的感染情況Fig.3a Infection status of P.canaliculata in GroupⅡ.Fig.3b Infection status of P.canaliculata in GroupⅢ.

2.6 螺重與易感性關系 對Ⅱ、Ⅲ組三類福壽螺感染廣州管圓線蟲螺和無感染螺的重量進行比較,發現無差別(P＞0.05),即福壽螺是否感染在成年螺中與其大小無關。而在感染L3的螺中,螺的重量與感染度亦無相關性。

3 討 論

在福壽螺的原發地——南美洲報道福壽螺有多種兼性和專性共生體[13-14],而無福壽螺感染廣州管圓線蟲報道,也并未對人類健康造成威脅[15]。而在福壽螺入侵地,主要在亞洲,感染廣州管圓線蟲的福壽螺致人患病已有多次暴發流行,給人的健康造成了嚴重威脅[5]。我們根據當地福壽螺外部形態將福壽螺分為3類,探討其對廣州管圓線蟲易感性,揭示其此生物學特點的不同,并為廣州管圓線蟲病的防治提供參考。

本實驗于春季進行,平均氣溫超過20℃,且實驗過程中供給充足食物,無蟲感染時,福壽螺的生長應該是連續的[16],且較小的螺生長更快[17]。然而在本實驗中,實驗組福壽螺均無生長,說明廣州管圓線蟲感染可能使螺的生長出現了停滯。實驗組螺在感染后活動率下降也說明廣州管圓線蟲的感染對福壽螺產生了負面影響。黑色福壽螺和灰色福壽螺實驗組與陰性對照組比較死亡率無差別,說明螺的死亡并非是由于感染引起,其死亡可能與氣溫水質、壽命等因素有關[16]。黃色福壽螺陰性對照組死亡大于實驗組,由于黃色福壽螺的感染率及感染度均較低,可能小劑量的廣州管圓線蟲的感染增強了其對外界環境的抵抗力,相關原因還需進一步的研究。

Ⅱ組三類福壽螺感染率及感染度無差別,而在Ⅲ組中,黃色福壽螺感染率低于灰色福壽螺,三類螺感染度無差別。由于灰色福壽螺重量較黑色福壽螺和黃色福壽螺小,我們還對三類螺的蟲密度進行了分析,發現同組三類福壽螺亦無差別。本實驗中,各感染組福壽螺感染率均較低,感染度亦不高,這與Smarn等[18]人的實驗結果相似,在他的研究中,隨著感染劑量的增加,蟲的回復率無升高甚至出現下降。可見,福壽螺感染廣州管圓線蟲的個體差異較大,這種差異掩蓋了感染劑量不同帶來的影響。然而,在本實驗中,我們發現實驗組即使在未發現L3的福壽螺體內亦有蟲鞘膜存在(Ⅱ組中數量較多,Ⅲ組中數量較少),這說明福壽螺被感染過,只是蟲由于某些未知因素的作用已死亡并被吸收,這種作用可能與福壽螺自身免疫以及蟲之間的相互作用有關[19]。另外,通過對實驗組螺重量的分析發現,福壽螺是否感染及感染蟲量的多少與螺的重量大小無關。

總之,福壽螺屬外來入侵物種,不同的生存環境下會產生不同的變異,包括外部形態的變異和某些生物學特征的變異。本文在對不同品系福壽螺對廣州管圓線蟲易感性的研究中發現,黃色福壽螺對廣州管圓線蟲的抵抗性較強。這可能與黃色福壽螺在中國多個省份所占比例較黑色福壽螺多的現狀有關[20]。當然,有關福壽螺其他的變異還需要更多的研究來證實。

(感謝武鴻美在福壽螺顯微結構的描述上對我們的幫助)

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