黃芪多糖體外抗CVB3病毒活性

鄭蘭兵 魏 青 劉小玲 劉小雷*

（1 內蒙古自治區第三醫院，內蒙古 呼和浩特 010010；2 內蒙古醫學院第一附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010059；3 內蒙古自治區醫院，內蒙古 呼和浩特 010018；4.內蒙古醫學院藥學院，內蒙古 呼和浩特 010059）

病毒感染是病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）最常見的病因，近年來，發病率有逐漸增多的趨勢，有多種可病毒引起VMC，其中以柯薩奇B組3型病毒（Coxsackie virus，CVB3）最為常見[1]。許多文獻報道中藥具有明顯的心肌細胞保護和抑制病毒增殖作用，黃芪就是其中最重要的一種。現研究發現黃芪中小分子化合物如黃芪甲苷、黃酮類具有肯定的抗病毒作用外，較大的分子化合物，黃芪多糖（ASP）也具有提高免疫保護心肌細胞的生物活性[2]。本文利用已經建立的病毒性心肌炎細胞模型，觀察黃芪多糖對心肌細胞的保護作用，并試圖探討其心肌保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物、病毒及細胞株

黃芪多糖（ASP），從蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch）Bge var. mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，黃芪多糖ASP（Astragalus Sachalinensis Polysaccaride），由中國科學院蘭州化學與物理研究所汪道全教授提供，質量分數95.6%；Wistar新生乳鼠心肌細胞，購自內蒙古大學動物中心，生產許可證：SCXK（蒙）2002-0001；VERO細胞：由中國軍事醫學科學院五所惠贈；CVB3病毒：中國科學院昆明病毒所提供。

1.1.2 主要試劑

免疫組織化學試劑盒（中山生物技術公司，SA102）；凋亡檢測試劑盒（寶賽生物技術公司，CX101-3）；心肌細胞anti-α-actin（中山生物技術公司，3111003）；鹽酸胍（華美生物工程公司，BR136）；CK-MB試劑盒（華美生物工程公司，03104）；LDH試劑盒（華美生物工程公司，031020）。

1.1.3 主要儀器

CO2孵箱：日本三洋株式會社；酶標儀（Model550）：美國Bid-Rad公司；低溫離心機（RC SC）：美國Sorvall公司；高速冷凍離心機（Z360K）：德國Hermle公司；微量移液器：德國EPPENDORF公司；生物倒置顯微鏡：日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 在VERO細胞上抗CVB3病毒實驗[3]

試驗方法參照文獻[3]。

1.2.2 在原代心肌細胞上抗CVB3病毒實驗[3]

試驗方法參照文獻[3]。

1.2.3 病毒繁殖抑制實驗[3]

試驗方法參照文獻[3]。

1.2.4 原代心肌細胞培養液心肌酶活性測定

1.2.4.1 LDH的測定

試驗方法參照文獻[4]。

1.2.4.2 CK-MB的測定

試驗方法參照文獻[4]。

2 結 果

2.1 ASP在VERO細胞上抗CVB3作用

VERO細胞試驗結果表明：ASP在31.3μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL濃度下，能抑制CVB3病毒對VERO細胞破壞作用，與陰性對照組（病毒）比較，OD值有顯著性差異，并呈效應與濃度依賴的關系（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 ASP抗CVB3病毒作用結果（VERO細胞）（±s，n=8）

表1 ASP抗CVB3病毒作用結果（VERO細胞）（±s，n=8）

注：與病毒對照比較：aP＜0.05，aaP＜0.01；與細胞對照比較：bP＜0.05，bbP＜0.01

組別 劑量（μg/mL） OD值細胞對照組 — 0.9493±0.1321病毒對照組 250TCID50 0.5801±0.1299bb病毒＋鹽酸胍組 31.3 0.6251±0.1567 62.5 0.8130±0.0869a 125.0 0.8275±0.0876a病毒+ASP組 7.8 0.5823±0.2292 15.6 0.6781±0.1424 31.3 0.7758±0.2305a 62.5 0.8058±0.1249a 125.0 0.9848±0.3392aa

2.2 ASP在新生乳鼠心肌細胞上對CVB3的作用

Wistar新生乳鼠心肌細胞CVB3感染48h后，心肌細胞出現萎縮、變形及脫落，感染后72h至第5天心肌細胞搏動減弱甚至停止，CPE增多。從表2數據可看出，病毒+ASP組（15.6μg/mL、31.3μg/mL、62.5μg/mL）乳鼠心肌細胞形態正常、搏動有力。MTT染色數據表明：給藥各濃度組與陰性對照組比較，乳鼠心肌細胞存活率明顯增高，各ASP組與陰性對照組比較，OD值有顯著性差異（P＜0.01），見表2。

表2 ASP抗CVB3病毒作用結果（原代心肌細胞）（±s，n=8）

表2 ASP抗CVB3病毒作用結果（原代心肌細胞）（±s，n=8）

注：與病毒對照比較：aP＜0.05，aaP＜0.01；與細胞對照比較：bP＜0.05，bbP＜0.01

組別 劑量（μg/mL） OD值細胞對照組 — 0.8028±0.1685病毒對照組 250TCID50 0.4088±0.0847bb病毒+鹽酸胍組 15.6 0.4203±0.0952 31.3 0.5985±0.1117aa 62.5 0.6323±0.1248aa病毒+ASP組 3.9 0.4532±0.0837 7.8 0.4564±0.0799 15.6 0.6409±0.1965aa 31.3 0.6439±0.0827aa 62.5 0.6594±0.2543aa

2.3 病毒繁殖抑制試驗影響

根據表3試驗數據，ASP給藥組在31.3μg/mL劑量下，已造成病毒繁殖抑制作用，125.0μg/mL濃度時與鹽酸胍對照組抑制作用一致，且有藥物濃度相關性。

表3 ASP對病毒繁殖抑制影響（VERO細胞）

2.4 對Wistar新生乳鼠心肌細胞LDH測定結果

從表4數據看到：ASP對Wistar新生乳鼠心肌細胞培養液中LDH活性影響，僅在高劑量下（62.5μg/mL）降低其酶活性（P＜0.05）。

２.5 對乳鼠心肌細胞培養液CK-MB測定結果

表4 ASP對原代心肌細胞上清培養液LDH活性影響（±s，n=8）

表4 ASP對原代心肌細胞上清培養液LDH活性影響（±s，n=8）

注：與病毒對照比較：aP＜0.05，aaP＜0.01 ；與細胞對照比較：bP＜0.05，bbP＜0.01

組別 劑量（μg/mL） 酶活力單位細胞對照組 — 6233.0±1024.0病毒對照組 250TCID50 8346.5±1875.0bb病毒+鹽酸胍組 15.6 6918.8±1028.5 31.3 6633.0±1326.1 62.5 6524.0±1423.5a病毒+ASP組 3.9 8308.8±1399.1 7.8 7730.5±1870.8 15.6 7663.5±1221.7 31.3 7015.0±1547.4 62.5 6595.0±1192.6a

從表5數據看到：ASP在31.3、62.5μg/mL濃度下可降低Wistar新生乳鼠心肌細胞培養液CK-MB酶活性，有藥物濃度相關性（P＜0.05、P＜0.01）。

表5 ASP對培養大鼠心肌細胞CK-MB活性的影響（加病毒48小時后）（±s）

表5 ASP對培養大鼠心肌細胞CK-MB活性的影響（加病毒48小時后）（±s）

注：與病毒對照比較：aP＜0.05，aaP＜0.01；與細胞對照比較：bP＜0.05，bbP＜0.01

組別 樣本數 劑量（μg/mL） 酶活力單位細胞對照組 8 — 68.9±18.5病毒對照組 7 250TCID50 152.4±34.8bb病毒+鹽酸胍組 8 15.6 116.2±31.8 8 62.5 75.1±20.5aa病毒+ASP組 6 3.9 126.0±10.8 8 31.3 113.7±25.91 8 7.8 113.5±23.9 8 15.6 112.5±35.9 8 31.3 99.5±19.1a 8 62.5 78.3±15.7aa

3 討 論

本文使用從蒙古黃芪中分離純化的黃白色粉末狀多糖，經測定為a-糖苷鍵連接，相對分子質量約35000，水解多糖檢出半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖及葡萄糖等。含有糖醛酸為葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，為水溶性酸性雜多糖。

CVB3病毒接種于VERO細胞時，可看到VERO細胞發生病變，表現為細胞萎縮、胞質顆粒化、折光度增強、與周邊細胞原有的緊密接觸漸漸消失，最后細胞變形破裂而從培養皿上脫落[5]。鑒于VERO細胞對CVB3病毒敏感這一特點，本文以VERO細胞為敏感細胞株，采用MTT染色法，研究了ASP在VERO細胞上的抗CVB3病毒作用。MTT染色結果表明：ASP在31.3μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL濃度下，能抑制CVB3病毒對VERO細胞的損傷，與陰性對照組比較，OD值有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），并呈效應與濃度依賴的關系。其作用可能是通過競爭抑制方式阻止CVB3病毒與VERO細胞結合，阻礙病毒的吸附而影響病毒的復制。

新生乳鼠心肌細胞在感染CVB3病毒后2～5d可出現明顯細胞病變，早期可直接損害心肌細胞，不僅能關閉細胞核酸及蛋白質的合成，且其蛋白酶A2能裂解心肌細胞中dystrophin蛋白，打亂心肌細胞骨架結構。后期可引起心肌細胞Ca2+內流增加，胞內Ca2+濃度超負荷從而導致心肌細胞變形、脫落、損傷、破裂及誘導心肌細胞凋亡[6]。由于心肌細胞的破裂其胞內乳酸脫氫酶（LDH）、磷酸激酸激酶（CKMB）釋放明顯增高。因此本文采用心肌細胞為敏感細胞株，觀察給予ASP后CVB3病毒對心肌細胞形態（MTT染色）及搏動影響，測定培養液中LDH及CK-MB的活性。從試驗數據可以看到，病毒+ASP組（15.6μg/mL、31.3μg/mL、62.5μg/mL）乳鼠心肌細胞與病毒對照組比較，細胞形態正常、搏動有力，MTT染色數據表明：給藥各濃度組與陰性對照組比較，乳鼠心肌細胞存活率明顯增高，OD值有顯著性差異（P＜0.01）。ASP在高劑量下（62.5μg/mL）降低乳鼠心肌細胞培養液中LDH酶活性（P＜0.05），同樣在31.3μg/mL、62.5μg/mL濃度下可降低CK-MB酶活性，且有藥物濃度相關性（P＜0.05、P＜0.01）。而病毒繁殖抑制的結果也表明，ASP可抑制CVB3病毒在VERO細胞內的復制。

本文僅觀察了ASP體外細胞水平上抗CVB3病毒活性，測定ASP在CVB3病毒的攻擊下對VERO和乳鼠心肌細胞的保護及對CVB3病毒的抑制。ASP的作用機制和對VMC臨床治療效果，尚需進行整體動物實驗進一步探討。

[1] 孫成文,周國贛,江巖,等.黃芪多糖抗氧化損傷作用的研究[J].中國藥理學通報,1996,12(2):161.

[2] 單俊杰,王順春,劉滌,等.黃芪多糖的化學和藥理研究進展[J].上海中醫藥大學學報,2000,14(3):61-64.

[3] 劉小玲,張勇,劉小雷.苦參系列生物堿體外抗CVB3病毒活性[J].沈陽藥科大學學報,2006,23(11):724-730.

[4] 劉小玲,張勇,劉小雷.廣棗總黃酮體外抗CVB3病毒活性[J].中國醫院藥學雜志,2007,27(12):1-5.

[5] 劉小雷,張憲武,于東升.病毒性心肌炎細胞調亡機制的探討[J].內蒙古醫學雜志,2005,6(37):92-97.

[6] 劉曉雷,宿瑞俊,賈秀珍,等.黃芪多糖體外抗病毒性心肌炎試驗研究[J].中國分子心臟病學雜志,2003,9(2):79.