全血pH環境對紅細胞膜流動性和膜蛋白的影響

高美霞 吳敏慧 紀云鵬 蔡 莉 王泰瑞 楊 瑩 梁文飚*

（江蘇省血液中心，江蘇 南京 210042）

紅細胞懸液由全血制備而來，是目前臨床輸血中使用最多的紅細胞類血液制劑。本研究探討了全血紅細胞用于MAP紅懸液制備前，其細胞外pH和作用時間對紅細胞膜流動性、膜蛋白和形態的影響，為探討某些特殊情況的血液（如不足量血）制備紅細胞懸液的應用潛能提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

HITACHI KY2000型半自動生化分析儀、JEM-1010透射電鏡、島津RF-540型熒光分光光度計、NanoDrop ND-1000微量紫外可見分光光度計、Bio-Rad電泳儀及Quantity One分析軟件；ACD-B全血保養液為山東威高公司產品，1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（diphenyl-hexatriene，DPH）為Sigma公司產品,標準分子量蛋白由MBI公司生產，游離血紅蛋白測定試劑由南京生物建成公司提供。

1.2 方法

1.2.1 紅細胞在不同pH值環境的處理

取常規的ACD-B全血保養液，通過緩慢滴加0.1mol/L NaOH制備成不同pH值（pH分別為5.0、5.6、6.2、6.8和7.4）的全血保養液。隨機選擇6名知情同意的相同血型健康獻血者、分別采集5mL肝素抗凝全血；立即將6份同型全血混合以減少個體差異，4℃條件下以等滲PBS（pH7.4）緩沖液，2000g離心10min，洗滌3次，稱重壓積紅細胞，將洗滌紅細胞均分6份，1份為對照，5份按紅細胞和全血保養液的體積比為4∶6的比例，懸浮在不同pH值的ACD-B全血保養液中，分別處理4h、8h和24h后。

1.2.2 紅細胞膜樣品的制備

低滲溶血法制備紅細胞膜，實驗組和對照組分別取0.5mL壓積紅細胞，PBS反復洗滌3次，用0.01mol/L tris-Hcl溶血破膜；然后以10000r/min離心15min，反復洗滌3次后的乳白色提取物即為紅細胞膜樣品，所有操作均在4℃條件下進行，ND-1000微量紫外可見分光光度計測定紅細胞膜蛋白濃度。

1.2.3 紅細胞膜蛋白SDS-PAGE電泳

測定紅細胞膜蛋白濃度，取20μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，Quantity One軟件分析紅細胞膜蛋白的組成。

1.2.4 紅細胞膜流動性的檢測

采用文獻[1]方法。采用熒光偏振法檢測熒光偏振度并計算出紅細胞膜的微黏度。用四氫呋喃作溶劑配制2×10-3mol/L的熒光探針DPH儲存液，于棕色瓶中4℃保存。臨用前用等滲PBS稀釋為2×10-6mol/L的工作液，取2mL紅細胞膜蛋白（蛋白濃度0.03g/L），加入2mL DPH工作液，37℃溫育30min，用熒光分光光度計，測定其熒光偏振度P（激光波長362nm，發射波長432nm激發狹縫10nm，發射狹縫10nm）。利用P與微黏度（η）的定量關系計算出紅細胞膜的微黏度。

其中IVV為起偏器與檢偏器光軸均在垂直方向時的熒光強度，IVH為起偏器光軸在垂直方向，檢偏器光軸在水平方向時的熒光強度IVV為二者光軸均在水平方向的熒光強度，IHV為起偏器光軸在水平方向、檢偏器光軸在垂直方向的熒光強度，G為校正因子，G=IHV/IHH。

1.2.5 上清FHb濃度的測定

分別在4h、8h和24h檢測實驗組和對照組上清中FHb濃度。

1.2.6 紅細胞膜形態的觀察

取1mm見方的紅細胞團塊，用2.5%戊二醛和1%鋨酸固定后，經脫干、墊入、分割、染色，置于電鏡下觀察、拍片記錄。

1.2.7 統計學處理

數據采用SPSS15.0進行重復測量數據分析。

2 結 果

2.1 不同pH值處理后，紅細胞膜熒光偏振度、微黏度和紅細胞上清中FHb濃度見圖1～3。

圖1 不同pH值儲存環境和保存時間對紅細胞膜熒光偏振度的影響

圖2 不同Ph值儲存環境及保存時間對紅細胞膜微黏度的影響

圖3 不同Ph值環境和儲存時間對游離血紅蛋白的影響

圖4 紅細胞膜蛋白SDS-PAGE電泳分析

圖5 紅細胞膜受pH值環境和儲存時間影響而發生形態學的改變

圖1中，0h與4h和0h與8h處理組中，除pH=6.8組外，各組的熒光偏振度有統計學意義（P＜0.01）；0h與24h處理組中，各組的熒光偏振度均有統計學意義（P＜0.01）；4h與8h處理組中，除pH為5.0和5.6組外各組的熒光偏振度有統計學意義（P＜0.01）；4h與24h處理組均有統計學意義（P＜0.01）；8h與24h處理組中除pH為5.0和5.6組外均有統計學意義（P＜0.01）。

圖2中，0h與4h和0h與8h處理組中，除pH=6.8組外，各組的紅細胞膜微黏度均有統計學意義（P＜0.01）；0h與24h處理組中，各組的紅細胞膜微黏度有統計學意義（P＜0.01）；4h與8h處理組中，除pH為5.0和5.6組外各組的紅細胞膜微黏度有統計學意義（P＜0.01）；4h與24h處理組均有統計學意義（P＜0.01）；8h與24h處理組中除pH為5.0和5.6組外均有統計學意義（P＜0.01）。

圖3中，0h與4h、0h與8h、0h與24h、4h與8h、4h與24h和8h與24h處理組中，除pH=6.8組外，各組的游離血紅蛋白有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 紅細胞膜蛋白SDS-PAGE電泳分析見圖4。

圖4中，C為正常對照組，1和2為分別在pH 5.0保養液中處理8h和4h的實驗組；3和4為分別在pH 6.2保養液中處理8h和4h的實驗組；5和6為分別在pH 6.8保養液中處理8h和4h的實驗組。

2.3 全血紅細胞胞外pH環境對細胞膜形態學的影響

顯微鏡下觀察的正常紅細胞，表面光滑，邊緣整齊。當紅細胞胞外pH＜6.8后，紅細胞膜形態發生改變，大部分表面棘狀突起有伸出，并伴隨有細胞的聚集，見圖5。

3 討 論

紅細胞周圍環境pH值的變化可影響脂雙層的穩定性和磷脂在細胞膜上的分布，可改變細胞膜的力學特性、細胞形態大小以及細胞內Hb分子的結構與濃度而影響紅細胞的功能和存活[2-4]。研究證實，紅細胞胞外酸堿度與細胞形態結構、膜的變形能力和流動特性以及血紅蛋白的攜氧能力相互密切關聯；Gedde報道[5]紅細胞在胞外pH值低于6.3時，紅細胞膜曲率為負數，可對胞膜的力學特性及細胞形態產生影響。DPH被認為是一種比較敏感的熒光探針，通過測定反映膜脂區域微黏度的熒光偏振度，可了解膜脂的流動性。我們利用DPH研究了不同pH值保養液和儲存時間對紅細胞熒光偏振度的影響，實驗結果表明，盡管沒有任何標本發生肉眼可見的溶血，但pH在5.0～5.6范圍內，紅細胞的偏振度和微黏度顯著上升，流動性變小；紅細胞分別在pH6.2和pH7.4的保養液中，其偏振度和微黏度的變化基本相同；只有在pH6.8的保養液中，紅細胞才具有與正常對照組相同的偏振度和微黏度以及較好的流動性。

紅細胞正常形態的維持依賴于細胞膜及膜骨架的支持，因此細胞形態可以反映細胞膜的結構和穩定性的變化。當紅細胞經不同pH值環境和儲存時間處理后，部分紅細胞發生棘突和形態改變，聚集程度增加，而膜上的自聚集作用可能導致膜融合和形成非專一性離子通道，從而破壞細胞膜結構。另外，紅細胞膜流動性的降低，也可造成細胞膜的損害甚至溶血。紅細胞在不同pH值保養液中的儲存時間對其微黏度和流動性的影響是顯著的，通過研究與紅細胞膜的彈性特性相關的內在性膜蛋白Band3的表達，我們發現在低于pH 6.8的儲存環境中，Band3的表達量隨著環境pH的降低和儲存時間的延長而顯著減少；而在pH 6.8的保養液中，Band3在4h內的表達量與正常對照組基本相同。Band3為多次跨膜蛋白，具有陰離子轉運功能，Band3和血型糖蛋白分別通過Band 2.1和Band 4.1與收縮蛋白結合，使骨架網絡附著于膜脂雙層上形成膜骨架[6]，低pH環境和保存時問的延長，導致Band3蛋白數量減少或被氧化、降解，與其他蛋白或自身交聯、構型改變，骨架蛋白失去與膜內表面的連接，紅細胞膜上的脂蛋白及脂質逐漸喪失，使紅細胞膜的微黏度升高，膜流動性降低，紅細胞逐漸變形，脆性增加。因此，初步的研究結果表明，盡早將紅細胞從異常pH環境中分離出來，對于保證紅細胞的結構和功能是非常必要的。

目前國內外采供血機構普遍使用ACD（pH 5.03），CPD（pH 5.60）和CPDA（pH 5.60）保養液采集全血，由于不足量血的紅細胞與保養液的比例失調，導致紅細胞的胞外pH值低于正常標準，進而影響紅細胞的能量代謝和生理功能。本研究的意義在于為進一步探討不足量血紅細胞的百分比含量以及全血分離時間與紅細胞懸液質量的關系，為不足量血潛在的綜合利用提供依據，不僅可進一步節約寶貴的血液資源，也體現了對無償獻血者的尊重，在目前血液供應緊張的情況下，不失為一種開源節流、合理用血的應對策略之一。

[1] Shinitzky M,Barenholz Y.Fluidity parameters of lipid regions determined by fluorescence polarization[J].Biochim Biophys Acta,1978,515(4):367-394.

[2] Libera J,Pomorski T,Muller P,et al.Influence of pH on phospholipid redistribution in human erythrocyte membrane[J].Blood,1997,90(4):1684-1693.

[3] Ivanov IT.Low pH-induced hemolysis of erythrocytes is related to the entry of the acid into cytosole and oxidative stress on cellular membranes[J].Biochim Biophys Acta,1999,1415(2):349-360.

[4] Crandall ED,Critz AM,Osher AS,et al.Influence of pH on elastic deformability of the human erythrocyte membrane[J].Am J Physiol,1978,235(5): C269-278.

[5] Gedde MM,Davis DK,Huestis WH.Cytoplasmic pH and human erythrocyte shape[J].Biophys J,1997,72(3):1234-1246.

[6] Salhany JM,Cordes KA,Sloan RL.Characterization of the pH dependence of hemoglobin binding to band 3: evidence for a pH dependent conformational change within the hemoglobin-band 3 complex[J].Biochim Biophys Acta,1998,1371(1): 107-113.