電化學(xué)發(fā)光法測定HBV標(biāo)志物與熒光定量PCR-HBV-DNA結(jié)果的分析比較

高 婭 王 婷

1.河南省嵩縣人民醫(yī)院檢驗科，河南嵩縣 471400；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，河南鄭州 450014

診斷是否感染HBV主要依賴血清標(biāo)志物檢測，傳統(tǒng)上用ELISA法檢測HBV標(biāo)志物，它主要反映人體對HBV的免疫狀態(tài)，不同血清標(biāo)志模式表示不同的臨床意義。HBV-DNA定量檢測可幫助臨床醫(yī)生判斷乙型肝炎患者的帶毒狀態(tài)和療效觀察[1]。本實驗采用比ELISA更為準(zhǔn)確敏感的電化學(xué)發(fā)光法檢測HBV標(biāo)志物，與實時定量PCR-HBV-DNA結(jié)果進(jìn)行分析比較，進(jìn)一步探討HBV標(biāo)志物與HBV-DNA的相關(guān)性，幫助臨床判斷乙肝患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況及其傳染性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2010年9 月～2011年6月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院診療的乙型肝炎患者204人，其中男138人，女66人，男女比例為2.1∶1，年齡19～82歲，平均（40.5±18.7）歲。

1.2 儀器和試劑

HBV標(biāo)志物的定量檢測儀器用Roche cobase 411；試劑為羅氏公司提供的專用試劑；PCR-HBV-DNA的檢測儀器用Roche Light Cycler 1.5；乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒由上海科華生物工程股份有限公司提供。

1.3 實驗方法

抽取實驗對象清晨空腹靜脈血并分離血清，用電化學(xué)發(fā)光法測定HBV標(biāo)志物，用實時熒光定量PCR方法檢測HBVDNA。結(jié)果判斷：PCR-HBV-DNA檢測范圍為≥5.0×102拷貝/mL，≥5.0×102拷貝/mL為陽性，＜5.0×102拷貝/mL為陰性。HBsAg的參考值為0～0.9 COI，0.9～1.0 COI為灰區(qū)，＞1.0 COI為陽性；HBsAb參考值為0～10 U/L，HBeAg的參考值為0～1 COI，HBeAb參考值＞1.0 COI，HBcAb參考值＞1.0 COI。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HBV標(biāo)志物檢測結(jié)果

HBsAg陽性結(jié)果5.95～10 490（4 846.7±3 196.7）；HBsAb陽性結(jié)果14.29～1 010 （271.4±349.3）；HBeAg陽性結(jié)果2.7～1 638（978.1±635.1）；HBeAb陽性結(jié)果0.003 ～ 0.798（0.123±0.251）；HBcAb陽性結(jié)果0.006～0.956（0.037±0.165）。各種血清學(xué)模式見表1。

2.2 HBV-DNA定量結(jié)果

在204例血清標(biāo)本中HBV-DNA陽性者78例，占38.2%，結(jié)果為501.4～43 450 000（6 027 900±13 840 000）。與HBV標(biāo)志物模式的比較見表1。

表2 HBV-DNA陽性患者乙肝五項定量結(jié)果與HBV-DNA陰性患者比較（± s）

表2 HBV-DNA陽性患者乙肝五項定量結(jié)果與HBV-DNA陰性患者比較（± s）

HBsAg（COI） HBsAb（IU/L） HBeAg（COI） HBeAb（COI） HBcAb（COI）HBV-DNA陽性HBV-DNA陰性P DNA定量與乙肝五項定量相關(guān)性4286±3274 2386±3439＞0.05 0.453 2.185±3.683 154.6±292.0＜0.05-0.463 639.2±730.8 70.13±272.4＜0.01 0.713 3.204±3.293 0.913±1.199＜0.05-0.541 0.008±0.003 0.152±0.488＞0.05-0.503

2.3 HBV-DNA陽性及陰性患者乙肝五項定量結(jié)果比較

HBV-DNA陽性患者HBsAb、HBeAg和HBeAb的定量結(jié)果與陰性患者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而HBsAg和HBcAb差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。DNA的定量值與HBsAg、HBeAg的定量值正相關(guān)；與HBsAb、 HBeAb 及HBcAb負(fù)相關(guān)，尤其與HBeAg和HBeAb的相關(guān)性最大。見表2。

3 討論

本實驗用電化學(xué)發(fā)光法檢測HBV標(biāo)志物，檢出21例ELISA法不常見模式（19例模式1和2例模式7），與傳統(tǒng)的ELISA法相比前者有如下優(yōu)點：ELISA法存在HBsAg漏檢的情況，電化學(xué)發(fā)光法檢測的靈敏度達(dá)0.01～0.04 IU/mL，大大優(yōu)于前者；Anti-HBc測定由于血清中乙肝核心抗體蛋白的干擾，可出現(xiàn)假陽性，而電化學(xué)發(fā)光法使用特制的DTT進(jìn)行標(biāo)本預(yù)處理后，能極大地減少假陽性；HBsAg與Anti-HBc的檢測都會受到干擾物質(zhì)非特異性信號的影響，電化學(xué)發(fā)光法采用靈敏的標(biāo)記物和高純度、高特異性的試劑，有效解決了非特異性信號的干擾[1]。因此電化學(xué)發(fā)光法測定HBV標(biāo)志物的靈敏性特異性均優(yōu)于ELISA，只是試劑價格昂貴，普通患者很難接受。

檢測HBV標(biāo)志物是臨床診斷乙型肝炎的依據(jù)和指標(biāo)，但主要反映人體對病毒感染的免疫狀態(tài)，不能直接反映HBV在體內(nèi)的復(fù)制情況，也不能作為判斷患者是否具有傳染性的直接證據(jù)。而PCR-HBV-DNA定量結(jié)果直接檢測病毒自身，可以更為準(zhǔn)確靈敏地反映病毒復(fù)制水平、病程變化和療效等情況，是反映是否具有傳染性的可靠指標(biāo)，從而利于臨床對乙型肝炎的診斷、治療方案的選擇和對療效的判斷[2]。本實驗結(jié)果顯示，模式4的患者HBV-DNA陽性率最高，含量也最高，同時HBeAg與DNA定量結(jié)果相關(guān)性最大（r=0.713），說明HBeAg存在時，病毒復(fù)制活躍并具有傳染性，建議在治療前后進(jìn)行HBeAg定量檢測，有助于預(yù)測療效、優(yōu)化治療方案。但隨著HBeAg轉(zhuǎn)陰和HBeAb的產(chǎn)生，并不是所有感染者HBVDNA都轉(zhuǎn)陰。在本實驗中模式1和2分別有21.1%和47.2%的HBV-DNA陽性率，研究發(fā)現(xiàn)乙肝病毒基因突變造成e抗原停止表達(dá)，但患者體內(nèi)HBV-DNA仍在復(fù)制并具有傳染性，而且變異后的病毒更不易清除，也更容易進(jìn)展到肝硬化，所以更應(yīng)該進(jìn)行HBV-DNA定量檢測，以便觀察療效[3]。

HBsAg是乙肝病毒S基因編碼的外膜蛋白，其存在只是HBV感染的指標(biāo)，而不能反映病毒復(fù)制情況及有無傳染性[4]。本實驗HBV-DNA陽性和陰性患者的HBsAg含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但DNA與HBsAg含量有一定相關(guān)性（r=0.453），因此HBsAg定量結(jié)果是否反映病毒載量及復(fù)制情況需進(jìn)一步研究。HBsAb產(chǎn)生并不意味病毒復(fù)制停止，在本研究模式1中有4例HBV-DNA陽性，這可能是因為HBV-DNA前C區(qū)發(fā)生突變出現(xiàn)免疫逃逸或者是不同亞型HBV重復(fù)感染[5]。單獨HBcAb陽性者（模式5）有50% HBV-DNA陽性率，兩者存在相關(guān)性（r=-0.503），有研究者認(rèn)為高滴度HBcAb提示HBV復(fù)制，但檢出率低，低滴度只表示既往感染；另有觀點稱HBcAb陽性多數(shù)情況是免疫記憶，少數(shù)存在病毒復(fù)制[6-7]。

綜上所述，HBV標(biāo)志物和HBV-DNA既相關(guān)又有所不同，應(yīng)將二者結(jié)合起來并相互補(bǔ)充，更加準(zhǔn)確地了解患者HBV感染、病毒復(fù)制和傳染性情況，為臨床制定合理的治療方案、療效觀察和預(yù)后評估提供依據(jù)。

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