結縷草根際聯合固氮菌培養條件研究

張曉波，趙 艷

（1.海南大學 農學院/熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室，海南 儋州 571737；2.山西農業大學 資源環境學院，山西 太谷 030801）

聯合固氮是自由生活的固氮菌定殖于植物根際土壤中形成的特殊固氮作用，它們對植物生長有著一定的促進作用［1］。目前，水稻、玉米等禾本科作物根際固氮菌的研究較深入［2－13］，對于禾本科牧草固氮菌的研究較少。而近年來，草坪業在我國作為新興產業，其發展速度日新月異，但化肥的大量使用嚴重影響了土壤結構，破壞了土壤的生態平衡，而固氮菌可以為作物提供氮素營養，并對促進生態系統中營養物質再循環，維持生物圈的正常功能起著重要作用。因此，固氮菌肥料在這一領域將會有廣大的前景。

試驗對結縷草（Zoysia japonica）根際土壤中分離到的5株固氮菌菌株的最適溫度、最適pH值以及最佳通氣量等條件進行研究，在上述基礎上測定各個菌株的典型生長曲線，這些數據對有效地利用和促進菌株生長具有重要現實意義，可為生物菌肥的研制及禾本科植物菌肥的使用提供必要的理論數據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株為從海南大學校內結縷草草坪根際土壤中分離、純化，并經形態學、生理生化特性鑒定及固氮酶活性測定篩選得到的高效固氮菌株，菌株標記為N1、N4、N5、N6、N8共5株，供試菌株的鑒定已在《草原與草坪》2011年第1期上發表，見參考文獻［14］，其固氮酶活性為194.5C2H4nmol/（mL·h）（N8）～215.4C2H4nmol/（mL·h）（N1）。

培養基為LB液體培養基［15］。

1.2 試驗設計

試驗均以未接菌的LB液體培養基為空白對照。

1.2.1 溫度條件對菌株生長的影響 按2%接種量分別將菌株接種到LB液體試管培養基中，每個菌種接種4管，分別于10、15、20、25、30、35、40、45℃振蕩培養（180r/min）48h，然后測定每個菌株的OD600nm吸光值，并計算平均值，以確定各菌株的最適生長溫度。以OD600nm吸光值為縱坐標，溫度為橫坐標，生成坐標圖。

1.2.2 初始pH對菌株生長的影響 將菌株按2%接種量分別接種到pH 為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB液體試管培養基中，每個菌種接種4管，置于180r/min 28℃的振蕩培養箱中培養48h，然后測定其OD600nm的平均吸光值，確定每種菌株的最適生長pH值。以OD600nm吸光值為縱坐標，pH為橫坐標，生成坐標圖。

1.2.3 通氣條件對菌株生長的影響 將菌株按5%的接種量接種到裝液量為30、50、100、150和180mL的三角瓶（250mL）中，28℃振蕩培養（180r/min）48h后測定OD600nm的平均吸光值。確定每種菌株的最佳需氧量。以OD600nm吸光值為縱坐標，通氣量梯度為橫坐標，生成坐標圖。

1.3 典型生長曲線的測定

將各菌株分別從保存的試管斜面上取一環接種于10mL液體LB培養基中，于28℃，150r/min振蕩培養12h作為種子液。

按2%的接種量將種子液接種于200mL LB液體培養基中，振蕩混勻，以每支10mL分裝于標記為0、2、4、6、8、10、12…24h的13支試管中，于每個菌株的最適培養條件下培養。按標記時間從上述試管中各吸取l mL培養液，加入9mL滅菌生理鹽水，混勻后取出1mL加入下一支9mL無菌的生理鹽水中，依次類推，對菌液作10倍梯度稀釋，稀釋度為10－1、10－2、10－3直到10－10，分別吸取各稀釋度菌液0.1mL涂布LB平板，3次重復，于每個菌株的最適溫度培養48h。計數菌液不同稀釋度的3次重復的菌落數，菌落數在30～300的為有效平板，求其平均值。計算出供試菌株各生長時間的菌數。

2 結果與分析

2.1 溫度對菌株生長的影響

5株固氮菌株在10～45℃的溫度均能生長（圖1），最適宜的生長溫度為20～30℃，菌株的最適溫度存在差異，即菌株N1在30℃時，菌株N4、N6、N8在25℃時，菌株N05在20℃時，對應其最高的OD600nm吸光值達到顯著水平（P＜0.05），OD600nm吸光值最高，即該溫度分別對應各菌株的最適生長溫度。

圖1 溫度條件對菌株生長的影響Fig.1 The effect of temperature on growth of strains

2.2 初始pH值對菌株生長的影響

從結縷草根際土壤中分離到的5株固氮菌株均能在pH 4.0～9.0生長，表明這些菌株對pH具有相對較廣的適應能力。各菌株的最適pH存在差異，即菌株 N1、N4、N6、N8最適初始pH 為7.0，N5為7.5吸光值達到顯著水平（P＜0.05），說明這5個菌株在初始中性或稍偏堿性的條件下生長較好。

圖2 pH值對菌株生長的影響Fig.2 The effect of pH on growth of strains

2.3 通氣條件對菌株生長的影響

從圖3可以看出，根據試驗中各菌株最適通氣量的測定，菌株 N04、N05、N06、N08通氣量為220mL時生長最好（吸光值達到顯著水平，（P＜0.05），說明越高的氧分壓越有利于菌株的生長；菌株N1在通氣量為200mL時最適宜其生長，吸光值達到顯著水平，（P＜0.05），但在通氣量為220mL時它們生長受到一定的阻礙。

2.4 典型生長曲線

由各個菌株的典型生長曲線可以看出，N1、N6菌株經過一個短暫的0～2h的延遲期，于2～14h時進入對數期，穩定期為14～18h，18h后進入衰亡期；菌株N4、N5經過0～2h的延遲期后，于2～16h進入對數期，16～20h進入穩定期，20h后進入衰亡期；菌株N08經過0～4h的延遲期后，于4～18h進入對數期，18～20h進入穩定期，20h后進入衰亡期。由以上分析可以看出，篩選到的菌株均具有比較明顯的延遲期、對數期、穩定期以及衰亡期。

圖3 通氣條件對菌株生長的影響Fig.3 The effect of oxygen conditions on growth of strains

圖4 菌株典型生長曲線Fig.4 The typical growth curves of strains

3 討論與結論

（1）前人研究表明，微生物在人工培養時直接受溫度條件的影響，適宜的培養溫度對微生物生長具有很大的促進作用［16］。湯春梅［17］以甘肅省東祁連山高寒地區禾本科牧草根際分離、篩選獲得的固氮菌株N4、X5、C－6、Dry6為材料，對其所需培養條件進行了研究，結果表明菌株X5、C－6最適溫度為30℃，Dry6最適溫度35℃，N4最適溫度25℃；張麗梅［18］對固氮菌株W12進行培養條件研究，試驗結果表明，該菌株的最適生長溫度為30℃；試驗中，菌株N1的最適溫度為30℃，與湯春梅［17］、張麗梅［18］研究的結果較為一致；菌株N4、N6、N8最適溫度為25℃，與湯春梅研究固氮菌株N4結果較為一致［17］。

（2）在微生物人工培養過程中，適合的初始pH值往往對該微生物本身及發酵生產在初期就產生促進作用，對于某種有益特定微生物種類來說，找到其發酵的最適初始pH值并應用，是工業培養及發酵生產過程中的一項重要措施之一。湯春梅［17］對固氮菌株N4、X5、C－6、Dry6進行了研究，結果表明，C－6初始pH 7.5時，X5初始pH 7.5～8.0時，N4、Dry6初始pH 8.0時，菌株的活菌數達最高。張麗梅［18］對固氮菌 W12菌株的研究結果則表明，最適初始pH為5.0～6.0。蔣瑋等［19］對固氮菌株HY1141進行了最佳培養條件研究，結果表明，培養基最適初始pH為7.0。試驗結果表明，菌株N04最適初始pH為7.5，與湯春梅［17］研究的菌株C－6結果較為吻合；菌株N1、N5、N6、N8最適初始pH值為7.0，與蔣瑋等［19］研究結果較為吻合，而與湯春梅［17］、張麗梅［18］研究的結果有一定差異。

（3）微生物對氧的需要和耐受能力在不同的類群中差別很大，所以在微生物人工培養過程中，通氣量也是一個關鍵的影響因素。目前，固氮菌通氣量的研究較少，在此次研究中，菌株N4、N5、N6、N8最適通氣量為220mL，菌株N01最適通氣量為200mL。這些數據可以對將來菌株的生產發酵提供一定的指導。

（4）利用典型生長曲線可以看出不同微生物在培養過程中進入延遲期、對數期、穩定期及衰亡期的時間，所以，根據典型生長曲線可以明確微生物的生長規律，對生產實踐具有重大的指導意義。有些學者已經對一些特異微生物的生長曲線進行了初步的研究，如李木桂等［20］對篩選出的3株溶藻菌L7，L8和L18進行了生長曲線的研究；陶令霞等［21］對固氮菌NT06的生長曲線進行了測定，試驗測定了從結縷草根際土壤中篩選的5株固氮菌的典型生長曲線，發現除菌株N08（延遲期為0～4h）外，其余4個菌株延遲期均為0～2h，但進入對數生長期以后所持續的時間也有所不同，菌株N1、N6為2～14h；菌株N4、N5為2～16 h，相比N1、N6延長了2h；相應地，N4、N5進入穩定期的時間又比N1、N6推遲了2h（16～20h）；菌株N8于4～18h進入對數期，18～20h進入穩定期。菌株N1、N6 18h后進入衰亡期，菌株N4、N5、N8 20h后進入衰亡期。說明不同菌株的生長發育特性有一定的差異，這些數據對今后菌株的生產及利用具有重要意義。

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