黑米花青素對大鼠視網膜光化學損傷感光細胞凋亡和Caspase－1表達的影響

陳瑋，賈皓，余小平＊，伍秀華，李帥，劉洪，廖紀如，凌文華

（1.成都醫學院公共衛生系，四川 成都 610083；2.中山大學公共衛生學院，廣東 廣州 510080）

視網膜光損傷包括機械損傷、熱損傷和光化學損傷，其中光化學損傷是造成視網膜病變最為重要的因素［1，2］。在視網膜色素變性（RP）中，感光細胞的死亡和丟失主要是由光氧化應激所誘導的細胞凋亡所致［1，2］。多種抗氧化劑皆能在一定程度上減輕氧化應激水平，抑制細胞凋亡，防護 RP［3－5］。花青素（Anthocyanins，ACs）是一類天然的植物多酚類化合物，具有較強的抗氧化和抗凋亡能力［6］。黑米花青素（BRACs）來自黑米皮，我們在前期研究中發現［7，8］，BRACs膳食干預能明顯抑制光氧化應激誘導的視網膜脂質過氧化，有效維護視網膜形態結構的完整。Caspase－1在視神經細胞凋亡中發揮關鍵作用［9］。本研究擬進一步觀察BRACs防護RPD中的抗凋亡作用，并檢測凋亡關鍵蛋白Caspase－1的表達水平，以探討BRACs防護RPD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

BRACs由中山大學凌文華教授提供；托吡胩胺滴眼液購自武漢五景藥業有限公司；RNA提取試劑盒、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT－PCR）試劑盒及引物合成皆由大連寶生物工程有限公司提供；原位末端標注（TUNEL）試劑盒、Caspase－1抗體和免疫組織化學檢測試劑購自武漢博士德生物有限公司；清潔級Spregue－Dawley大鼠由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供；CMC－I型輻照儀、ST－80型數字式照度計由本課題組與西南大學聯合研制。FV1000激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司；PCR儀和核酸蛋白凝膠成像儀購自美國Bio－Rad公司。

1.2 實驗分組及處理

60只Spregue－Dawley大鼠，鼠齡6周，平均體重（160±15）g，雌雄不限，飼以AIN－93基礎飼料正常光照適應1周后，隨機分為對照組（n＝30）和BRACs組（n＝30），二者均飼以基礎飼料，12h明／12h暗循環光照，其中BRACs組按100mg／kg·bw劑量給予BRACs，每天灌胃1次，對照組則予等量生理鹽水灌胃1次。處理15d后，兩組動物同時給予（3000±200）lux強度的白色熒光持續光照24h，RP模型參照文獻［5］的方法建立。

1.3 組織取材與切片制作

大鼠光照后，乙醚麻醉，迅速摘取眼球，其中左眼球提取總RNA，右眼球則置于10%的福爾馬林液中固定24h，然后常規脫水，浸蠟、石蠟包埋，經視神經矢狀縱切，制成5μm厚切片，用于TUNEL和免疫組織化學檢測。

1.4 細胞凋亡檢測

視網膜細胞凋亡檢測采用TUNEL法。取前述制備的視網膜石蠟切片，按試劑盒說明進行操作，激光共聚焦顯微鏡觀察并分析。凋亡結果以凋亡指數（apoptotic index，AI）表示（AI＝凋亡細胞數／細胞總數×100%）。

1.5 視網膜總RNA提取及RT－PCR

按RNA提取試劑盒說明提取左眼球總RNA，核酸蛋白微量檢測儀測定其含量與純度，－80℃保存。

RT－PCR按試劑盒說明進行，內參GAPDH上游引物：5＇－GTG CTG AGT ATG TCG TGG AGT CT－3＇，下 游 引 物：5＇－GTG GAA GAA TGG GAG TTG CTG T－3＇，擴 增 長 度 610 堿 基 對 （bp）；Caspase－1 上 游 引 物：5＇－GTG GAG AGA AAC AAG GAG TGG T－3＇，下 游 引 物：5＇－TCA GTG GTT GGC ATC TGT AGT C－3＇，擴增長度310bp。擴增條件為：94℃預變性2min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循環33次。

RT－PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，Bio－Rad凝膠成像分析系統掃描分析。半定量PCR特異條帶值以相對吸光度（intensity）×面積（mm2）表示，mRNA表達結果以各組的吸光度與內參GAPDH吸光度的比值表示（V value）。

1.6 免疫組織化學法檢測Caspase－1蛋白表達

免疫組織化學染色法按博士德公司說明書操作。石蠟切片常規脫蠟至水，30ml／L H2O215min，滅活內源性過氧化物酶，抗原修復，正常羊血清封閉組織非特異性抗原，15min，棄上清，滴加Caspase－1抗體［陰性對照用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗］，37℃、孵育1h；PBS蕩洗，滴加生物素化二抗，37℃、孵育30min；PBS蕩洗，滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉卵白素，37℃、30min，PBS沖洗，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，反藍，脫水透明封片，普通光學顯微鏡觀察，拍照。

1.7 統計學處理

實驗數據用SPSS 13.0統計軟件進行分析，結果以均數±標準差（±s）表示。ANOVA單因素方差分析檢驗同一組內不同光照時相點差異，t檢驗比較組間差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BRACs對視網膜光化學損傷中感光細胞凋亡的影響

TUNEL法檢測結果顯示，光照后視網膜感光細胞陽性率顯著增加（P＜0.01），而BRACs組感光細胞凋亡陽性率顯著低于對照組（P＜0.01）（圖1）。

2.2 BRACs對視網膜感光細胞 Caspase－1mRNA表達的影響

RT－PCR檢測結果顯示，光照后視網膜感光細胞Caspase－1mRNA表達增加。而BRACs干預使其表達下調，并在0、3、24h處顯著低于對照組（P＜0.05）（圖2）。

2.3 BRACs對視網膜感光細胞Caspase－1蛋白表達的影響

免疫組織化學染色結果顯示，Caspase－1陽性染色呈棕黃色。未光照的大鼠視網膜未見明顯著色（圖3A）；光照24h對照組和BRACs組視網膜外核層和內核層均出現陽性染色（圖3B）；而相對于對照組，BRACs組視網膜的陽性染色強度明顯低于對照組，即BRACs干預抑制光照后Caspase－1蛋白的表達（圖3B，3C）。

3 討論

氧化應激和氧化應激誘導的細胞凋亡在視網膜光化學損傷過程中起著關鍵作用［1，2］。前期研究發現，BRACs干預能夠明顯減輕光誘導的氧化應激水平，維護視網膜組織形態的完整［7，8］。本研究進一步探討了BRACs對RPD感光細胞凋亡和凋亡蛋白caspase－1表達的影響。

圖2 BRACs降低視網膜感光細胞caspase－1mRNA表達（n＝3）Fig.2 BRACs down－regulated the mRNA expression of caspase－1in photochemical damaged retinas（n＝3）

細胞凋亡在視網膜的發育和病變過程中發揮著重要作用。研究表明，急性光損傷中感光細胞丟失的主要方式是凋亡［1，2］。已有研究顯示，各種內源和外源的抗氧化劑能降低光氧化應激，抑制感光細胞凋亡［3－5］。本研究結果顯示，BRACs干預顯著降低凋亡感光細胞的數量，具有明顯的抗凋亡作用。結合前期研究發現BRACs的抗氧化作用，進一步證實氧化應激及其誘導的凋亡在視網膜光化學損傷中的關鍵作用。

半胱氨酸蛋白酶家族在細胞凋亡過程中起著關鍵作用。其級聯活化是細胞凋亡的中心環節。Caspase－1是該家族中第一個被發現和命名的成員，主要負責白細胞介素（IL）－1β的成熟和轉運，參與炎癥反應［9］。

Katai等［10］首先發現，Caspase－1在感光細胞凋亡中具有重要作用。Krishnamoorthy等［11］的體外實驗證實，抑制Caspase－1可以保護光誘導的感光細胞凋亡。Wu等［12］發現，在視網膜光化學損傷中，高強度的持續光照可使小鼠視網膜感光細胞內NF－κB活性降低，Caspase－l表達增加，從而促進感光細胞凋亡。前期研究發現，膳食添加牛磺酸可下調Caspase－l表達，抑制光氧化應激誘導的感光細胞凋亡［5］。本研究結果提示，BRACs灌胃干預能有效防護細胞凋亡，顯著抑制Caspase－l的mRNA和蛋白表達水平，進一步證實了Caspase－l在視網膜光損傷病變中的重要作用。

綜上所述，本研究結果顯示，BRACs可能通過下調Caspase－l表達，抑制感光細胞凋亡，有效降低光氧化應激誘導的視網膜光化學損傷，而有關BRACs通過何種途徑調節Caspase－1表達，則有待深入研究加以探討。

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